铅在工业上和日常生活中被广泛应用,而且铅在环境中不可降解,所以环境铅污染日益严重。铅具有很强的组织亲和性,对肝、脑、血液、免疫等系统均产生不利影响。铅影响神经系统的多种功能,它对神经发育的毒性作用一直是各国学者研究的焦点,尤其能影响婴幼儿和儿童发育的中枢神经系统(CNS),从而造成智力、记忆力、神经行为的障碍。然而,铅导致神经发育毒性的机制尚未阐明。哺乳类动物和线虫突变型细胞的特异基因表达研究证明,很多POU蛋白与神经系统发育有关。但铅暴露大鼠神经组织POU蛋白的表达模式有何改变以及这种改变与神经后期发育毒性的内在联系也未见报道。本实验试图从分子水平上揭示铅引起神经后期发育毒性作用机制。我们研究在孕鼠妊娠后期至哺乳期结束时段低剂量铅暴露情况下,POU蛋白在子代大鼠不同脑区的表达模式的变化,并探讨这种变化与神经后期发育毒性的内在联系。本研究分四部分,研究内容及结果报告如下:第一部分铅暴露大鼠空间学习记忆能力的变化目的:重金属铅具有很强的神经发育毒性,即使是低水平铅暴露,仍然可以损害发育中的神经系统,在儿童主要表现为学习记忆能力降低及行为发育异常。目前的流行病学研究和动物实验研究还表明,个体发育早期(主要是怀孕/哺乳期)铅暴露所产生的认知和神经行为缺陷在停止铅暴露后可能持续到成年阶段。我们以大鼠为实验对象,复制了围产期醋酸铅暴露动物模型,观察铅的神经毒作用,探讨其神经行为和学习记忆能力的变化。方法:雌鼠受孕后分笼饲养,并记录该鼠编号和受孕日期(E=0)。将20只受孕雌鼠随机分为4组,每组5只,妊娠第15天(E=15)开始将受孕雌鼠经饮水染毒,至仔鼠21日断乳时终止对亲代大鼠染毒,子代大鼠恢复正常饮水。子代大鼠从胚胎晚期至出生后21日断乳这段时间内,经亲代大鼠胎盘和乳汁实现铅暴露,具体分组如下:(1)对照组饮用蒸馏水;(2)低剂量组饮用含0.5g/L醋酸铅水;(3)中剂量组饮用含1.0g/L醋酸铅水;(4)高剂量组饮用含2g/L醋酸铅水。Morris水迷宫实验是检测动物的空间学习记忆能力的一种方法,我们采取这种方法观察铅暴露是否对大鼠的认知能力造成影响。结果:随着染毒剂量的升高,大鼠寻找平台所用时间呈现明显增加的趋势,所经总路径也呈增加的趋势,与对照组相比其统计学差异均有显著性(P<0.05或P<0.01),并有一定的剂量-效应关系(r值分别为0.538和0.569,P<0.01)。说明大鼠的学习记忆能力受到一定的影响。结论:通过Morris水迷宫实验检测,发现铅暴露大鼠空间学习记忆能力下降,提示在胚胎晚期及出生早期的铅暴露已使大鼠的中枢神经系统已经受到一定程度的损伤。第二部分铅暴露大鼠POU蛋白在中枢神经系统中表达的变化目的:POU家族转录因子中有很多被证明在神经系统的发育和功能中起了重要的作用。Oct-2最早是因其在B细胞中能刺激免疫球蛋白合成的基础上被发现的,而Brn-3转录因子是用RT/PCR方法分离新的功能尚不清楚的POU转录因子的过程中被发现的。这些因子都被证实在发育和成熟的神经系统中起了重要的作用。在铅暴露大鼠的脑组织中它们的正常表达是否受到一定的影响还未有研究,本实验试图从基因转录和蛋白质表达水平上进行观察,以期从分子水平上揭示铅引起神经后期发育毒性作用机理。方法:随机取各组仔鼠断头,制作冰冻切片,采用免疫组织化学(即用型SP检测系统)检测Brn-3a、Oct-2阳性神经元的表达;采用原位杂交检测Brn-3a、Oct-2的mRNA;取各组仔鼠脑组织提取RNA,采用逆转录酶-聚合酶链反应检测Brn-3a、Oct-2的mRNA。结果:图像分析和统计学检验结果表明,与对照组相比,低铅组Brn-3a免疫反应阳性神经元无明显变化,中铅组可见不同程度的变化,高铅组阳性面积比减少,平均灰度升高,表明Brn-3a蛋白表达在数量及强度上均低于对照组(P<0.05或P<0.01)。与对照组相比,低铅组Oct-2免疫反应阳性神经元无明显变化,中铅组开始可见不同程度的变化,高铅组阳性面积比增加,平均灰度降低,表明Oct-2蛋白表达在数量及强度上均高于对照组(P<0.05或P<0.01)。原位杂交检测Brn-3a的mRNA图像分析结果表明,与对照组相比,在大脑皮层和海马部位可见平均灰度值升高(P<0.05),表明mRNA的表达量减弱,而小脑部位未见明显变化(P>0.05)。在海马部位还可见阳性面积比显著下降(P<0.01)。本实验条件下,Oct-2的mRNA未检出。凝胶图像分析系统对扩增产物的电泳条带进行密度分析表明,海马组织Brn-3amRNA含量随染铅剂量升高而逐步明显减少(P<0.05),大脑皮层和和小脑未见明显差异(P>0.05)。本实验条件下,未能扩增出Oct-2目的条带(415bp)。结论:在本研究的铅暴露动物模型中,我们观察到在不同脑区,Brn-3a无论是基因表达水平还是蛋白表达水平都有不同程度的下降,提示铅可能干扰了Brn-3a的正常表达模式;同时我们观察到在不同脑区,Oct-2蛋白表达水平都有不同程度的升高,提示铅可能干扰了Oct-2的正常表达模式,并由此影响神经元的正常分化。第三部分铅暴露大鼠神经组织特异性蛋白在中枢神经系统中表达的变化目的:研究表明,Brn-3a的POU结构域除了调节它与DNA的结合,也能诱导那些蛋白产物很可能参与轴突生长的基因的表达(比如SNAP-25蛋白和神经丝蛋白),因此Brn-3a能促进神经生长进程。铅暴露大鼠神经元中这些相关神经特异性蛋白的表达是否也发生了变化是我们关心的问题,本实验试图从基因转录和蛋白质表达水平上进行观察,以期从分子水平上揭示铅引起神经后期发育毒性作用机制。方法:随机取各组仔鼠断头,制作冰冻切片,检测神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白阳性神经元的表达;取各组仔鼠脑组织提取RNA,采用逆转录酶-聚合酶链反应检测脑源性神经营养因子的mRNA。结果:图像分析和统计学检验结果表明,与对照组相比,低铅组、中铅组神经丝蛋白阳性细胞无明显改变,而高铅组大脑皮层、海马和小脑神经丝蛋白阳性细胞普遍数量减少,着色变浅,蛋白表达减少。而且在海马和小脑有一定的剂量-效应关系(r值分别为0.653和0.608,P<0.01)。免疫组化图像分析和统计学检验结果表明,与对照组相比,低铅组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞无明显改变,中铅组局部开始变化,而高铅组大脑皮层、海马胶质纤维酸性蛋白阳性细胞面积减少(P<0.05),着色变浅(P<0.01),蛋白表达减少,但在小脑该阳性细胞变化不明显。采用凝胶图像分析系统对扩增产物的电泳条带进行密度分析,结果表明,海马组织脑源性神经营养因子mRNA含量随染铅剂量升高而逐步明显减少(P<0.05)。结论:在动物实验中我们发现,正常情况下发育后期大脑神经丝蛋白的量表现出较高的表达水平,这应是神经元分化成熟、轴突伸长的自然表现。但铅的处理使神经丝蛋白的含量下降,不难看出铅严重抑制了神经元轴突生长过程,这使大脑的结构和功能受到严重的破坏。在本研究中发现,胶质纤维酸性蛋白在脑组织中的表达也有下降的趋势。本实验大鼠海马组织脑源性神经营养因子的mRNA阳性产物含量随染铅剂量升高而逐步明显减少,说明铅暴露可能通过某些途径影响其正常表达。第四部分铅暴露大鼠中枢神经系统细胞凋亡的变化目的:大量的研究表明,在神经系统的发育过程中,各种脊椎动物的中枢神经系统和外周神经系统的各个部位都有细胞程序性死亡(细胞凋亡)的发生,它具有重要的生物学意义。整个神经系统的发育是在神经细胞的增殖与凋亡的动态平衡中进行的。发育中的细胞死亡是一个积极的和有控制的现象,是为了神经系统的良好发育。因此,细胞凋亡在个体发育过程中具有重要意义,可以说没有细胞凋亡就没有个体发生。研究表明Brn-3a蛋白的N端结构域是刺激某些基因所必需的,比如Bcl-2基因,并由此促进提高神经元的存活水平。铅暴露大鼠中枢神经系统细胞凋亡是否发生变化,以及POU蛋白Brn-3a在其中所起的作用是本实验所关心的问题。方法:制作冰冻切片,采用HE染色从形态学角度观察细胞凋亡的发生程度;制作单细胞悬液,应用流式细胞术采用Annexin-V与PI双染法以及原位末端标记技术测定细胞凋亡;制作单细胞悬液,采用间接免疫荧光反应测定Bcl-2蛋白的表达水平。结果:高铅组大多数皮层、海马锥体神经元及小脑蒲肯野细胞表现出凋亡细胞特有的形态学特征。经Annexin-V与PI双染法测定,在所测的对照组和高剂量染铅组样品中,均可见细胞凋亡的发生,但受试组细胞凋亡率表现出明显增高的趋势,其统计学差异有显著性(P<0.01),表明醋酸铅可以诱导细胞凋亡。TUNEL法测定结果表明,与对照组相比,在低、中剂量组未见细胞凋亡有增加的趋势,在高剂量组各脑区均可见细胞凋亡有显著升高(P<0.05或P<0.01)。间接免疫荧光反应测定Bcl-2阳性细胞表达率表明,除低剂量染毒组外,中、高铅组大脑皮层、海马、小脑细胞虽然有Bcl-2阳性细胞表达,但与对照组相比有下降趋势,其阳性细胞表达率差异有显著性(P<0.05或P<0.01),并有良好的剂量-效应关系(r值分别为-0.897、-0.825和-0.849,P<0.01),表明铅可降低抗凋亡蛋白Bcl-2的正常表达。结论:本研究通过对母鼠在围产期染铅,观察到初断乳子代大鼠海马和其他脑区神经细胞过度凋亡,提示铅还可能通过降低Brn-3a的表达导致Bcl-2的转录和表达的减少,从而促进细胞凋亡进程。综上所述,中枢神经系统POU蛋白表达模式的紊乱可能是铅产生神经毒性作用的重要原因之一。铅暴露子代大鼠的POU蛋白表达变化可能引起下游基因表达的变化,从而影响神经细胞的正常分化、神经突触长出和延长、多巴胺能神经元的正常功能及信息传递和神经细胞凋亡等。