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目的：
1、研究siRNA对乳腺癌细胞MDA-MB-435表面α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalⅠ)水平的下调作用。
2、研究乳腺癌细胞MDA-MB-435表面ST6GalⅠ水平下调后,增敏紫杉醇对该细胞的凋亡诱导效应。
3、研究乳腺癌细胞MDA-MB-435表面ST6GalⅠ水平下调后,联合应用紫杉醇对该细胞与细胞外基质黏附作用的影响。
方法：
1、siRNA对α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalⅠ)水平的下调作用。
1)、构建低α-2,6-唾液酸转移酶乳腺癌细胞模型(即AS细胞):以ST6GalⅠ的siRNA沉默乳腺癌细胞MDA-MB-435 ST6 GalⅠ mRNA的表达,构建稳定的低a-2,6.唾液酸转移酶乳腺癌细胞模型；同时构建乳腺癌细胞空载体模型(即MOCK细胞)作为对照；
2)、以RT-PCR检测MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞中ST6GalⅠ mRNA的表达水平；
3)、以FITC-MAA、FITC-SNA、FITC-PNA标记MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞,用流式细胞仪检测各组细胞表面α-2,3-唾液酸、α-2,6-唾液酸和细胞表面总唾液酸的表达水平。
2、乳腺癌细胞表面ST6GalⅠ水平下调后,对紫杉醇诱导该细胞凋亡的增敏效应。
1)、紫杉醇对不同唾液酸化的乳腺癌细胞(MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞)的凋亡敏感性比较:以10-5mol/L、10-7mol/L、10-9mol/L三个浓度紫杉醇分别处理MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞,酶联免疫检测仪检测吸光度,进而筛选出紫杉醇诱导三组细胞凋亡的最佳浓度；
2)、以筛选出的紫杉醇浓度处理三组乳腺癌细胞(MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞),台盼蓝染色显微镜下观察细胞形态,并计算紫杉醇作用下各组细胞的存活率；
3)、以筛选出的紫杉醇浓度处理三组乳腺癌细胞(MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞),AnexinV-PI双染凋亡试剂盒标记,用流式细胞仪检测紫杉醇对其的诱导凋亡情况；
4)、以筛选出的紫杉醇浓度处理三组乳腺癌细胞(MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞),用caspase-3试剂盒检测各组细胞中caspase-3酶活性,进而了解紫杉醇对其的诱导凋亡情况；
5)、以筛选出的紫杉醇浓度处理三组乳腺癌细胞(MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞),用caspase-8试剂盒检测各组细胞中caspase-8酶活性,进而了解紫杉醇对其的诱导凋亡情况。
3、乳腺癌细胞MDA-MB-435表面ST6GalⅠ水平下调后,联合应用紫杉醇对该细胞与细胞外基质黏附作用的影响。
1)、MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞与不同浓度的细胞外基质(FN/CollagenⅣ)黏附实验,用CCK-8细胞活性检测试剂盒检测黏附细胞数量差异,选择出用该两种细胞外基质进行黏附实验所需的最佳ECM含量；
2)、用最佳的FN/CollagenⅣ量铺板,进行MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞与细胞外基质(FN/CollagenⅣ)黏附实验,比较三组细胞间的黏附性差异,用CCK-8细胞活性检测试剂盒检测黏附细胞数量差异；
3)、联合应用紫杉醇后,用最佳的FN/CollagenⅣ量铺板,进行三组细胞与细胞外基质(FN/CollagenⅣ)黏附实验,用CCK-8细胞活性检测试剂盒检测黏附细胞数量差异。
结果：
1、RT-PCR检测MDA-MB-435母代细胞、AS细胞、MOCK细胞中ST6GalⅠmRNA的表达水平:母代细胞表达量最高,其次是MOCK细胞,AS细胞中ST6GalⅠ mRNA的表达水平最低。说明siRNA对α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalⅠ)水平具有下调作用。
2、流式细胞仪检测各组细胞表面唾液酸的表达水平:三组细胞中,以FITC-PNA和MAA抗体标记的表达水平无明显差异,但以FITC-SNA抗体标记的在AS细胞中表达水平明显下降。
3、以10-5mol/L、10-7mol/L、10-9mol/L三个浓度紫杉醇分别处理三组细胞,筛选出紫杉醇诱导三组细胞凋亡的最佳浓度为:10-7mol/L。
4、以10-7mol/L的紫杉醇处理三组乳腺癌细胞,用台盼蓝染色显微镜下细胞存活率计数结果显示:MDA-MB-435母代细胞形态尚可,包膜完整,胞质清亮,存活率约为82％；MOCK细胞胞体变大,变圆,部分细胞发生融合,存活率约为67％:AS细胞出现大量融合,细胞呈圆形,胞膜不规则,不完整,存活率仅为48％。
5、以10-7mol/L的紫杉醇处理三组乳腺癌细胞,流式细胞仪检测结果显示:母代细胞凋亡百分率为9.1％,MOCK细胞凋亡百分率为17.3％,AS细胞凋亡百分率为30.2％。
6、以10-7mol/L的紫杉醇处理三组乳腺癌细胞,caspase-3试剂盒检测结果显示:AS细胞中easpase-3酶活性最大,紫杉醇对其诱导凋亡作用最强；MOCK细胞和母代细胞中caspase-3酶活性明显低于AS细胞,两者之间差别不大。
7、以10-7mol/L,的紫杉醇处理三组乳腺癌细胞,caspase-8试剂盒检测结果显示:AS细胞中caspase-8酶活性最大,紫杉醇对其诱导凋亡作用最强；MOCK细胞和母代细胞明显低于AS细胞。
8、三组细胞与不同浓度的细胞外基质(FN/CollagenⅣ)黏附实验结果显示:随着ECM含量的增加,发生黏附的细胞数量也增加,两者近似呈线性关系。母代细胞与细胞外基质的黏附性最强,MOCK细胞情况与其相仿,而AS细胞的黏附性最弱,同时,与FN黏附的细胞数量要高于与CollagenⅣ黏附组。选择出用该两种细胞外基质进行黏附实验所需的最佳ECM含量,即5μg/孔。
9、用5pg/孔FN/CollagenⅣ铺板,三组细胞与它们黏附实验结果显示:母代细胞与细胞外基质的黏附性最强,MOCK细胞情况与其相仿,而AS细胞的黏附性最弱。其中铺FN组的黏附性要强于铺CollagenⅣ组。
10、联合应用紫杉醇后,用5μg/孔FN/CollagenⅣ铺板,三组细胞与细胞外基质的黏附性显示:均较未用紫杉醇时黏附性降低,其中母代最强,MOCK细胞略低于母代细胞,而AS细胞的黏附性最弱。同样,铺FN组细胞的黏附性要强于铺CollagenⅣ组。
结论：
1、证实siRNA对α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalⅠ)水平具有下调作用。
2、乳腺癌细胞表面ST6GalⅠ水平下调后,可以增敏紫杉醇对该细胞的凋亡诱导效应。
3、乳腺癌细胞MDA-MB-435表面ST6GalⅠ水平下调后,联合应用紫杉醇可以进一步降低该细胞与细胞外基质黏附作用。