论文部分内容阅读
研究背景胰腺癌患者不仅承受肿瘤本身带来的痛苦,同时也经历着悲痛、沮丧、绝望等心理压力。越来越多的证据表明,儿茶酚胺类的神经递质参与调控肿瘤的发生和演变。研究表明,吸烟和慢性压力导致的β-肾上腺素受体激活参与胰腺癌的发生发展,是胰腺癌演变的关键风险因子。此外,研究表明胰腺癌组织及胰腺癌细胞大量表达肾上腺素受体,提示肾上腺素信号在胰腺癌演变中发挥重要作用。肿瘤转移是肿瘤致死的关键原因;而胰腺导管癌是高度侵袭转移的恶性肿瘤,预后差。截至目前,肾上腺素受体信号是否参与胰腺癌细胞侵袭转移尚不清楚。转化生长因子TGF-β介导的信号在肿瘤转移中发挥重要作用,而且其促进转移的作用与肿瘤发展阶段密切相关。在肿瘤演变的后期,TGF-β可以通过促进转移促进恶性演变,而TGFβ信号自身受到了表观遗传和转录调控的协同调控。近年来,研究发现控制m RNA翻译效率和降解的转录后调控是基因表达调控的重要方式;而包括TGF-β在内的多个信号通路都受到转录后调控方式的精细调节。ELAV家族成员RNA结合蛋白Hu R是目前研究最为充分的RNA结合蛋白之一,研究发现Hu R可以通过识别靶基因3’非翻译区(UTR)的富含AU的结构(AREs),稳定目的m RNA。先前研究发现,多种压力条件下Hu R能够活化,进而促进靶基因表达,在肿瘤演变中发挥重要作用。综上,我们推测,胰腺癌心理压力可能通过肾上腺素-Hu R-TGFβ调控轴,参与胰腺癌肿瘤转移。材料与方法细胞培养采用1640培养基(Invitrogen)培养人胰腺癌细胞系PANC-1,细胞培养基中同时添加2 m M glutamine,200μg/ml penicillin,100μg/ml streptomycin和10%fetal bovine serum(FBS)(四季青,杭州)。培养条件为:37℃恒温保湿。对照及Hu R干涉序列合成与转染设计针对Hu R和不针对任何基因的干涉序列,各三对,交由上海吉玛基因合成公司合成。RNAi转染采用Lipofectamine2000,转染终浓度为100 n M。转染12 h后,细胞更换带血清的全培养基继续培养,以用于后续实验。细胞迁移采用细胞迁移小室(Transwell,Corning Inc.,Corning,NY,USA)探讨细胞迁移。将1.0×104细胞铺种于上层小室,然后在下层培养基中添加10%的胎牛血清,作为趋化源。8 h后,棉签去除小室上侧面的细胞,结晶紫染色显示细胞迁移进入小室膜下层侧面的细胞,并对细胞进行计数。Western blot检测蛋白表达收集培养细胞,冰PBS清洗后,分别进行全细胞裂解和胞浆胞核亚组分分离。蛋白裂解液采用BCA蛋白定量后,将等量的蛋白样品上样。SDS-PAGE电泳后转移至NC(硝酸纤维素膜)。完成膜转以后,先进行封闭,然后孵育抗Hu R,p Smad2,p Smad3,Smad2/3,lamin B和β-actin等抗体。抗体孵育4℃过夜后,TBS-T清洗并进行二抗染色。TGFβ荧光素酶报告系统将3×SBE报告载体与内参质粒p RL-TK共转染至PANC-1细胞。转染报告基因后,细胞进一步进行对照及肾上腺素、Hu R干涉等处理。处理结束后,PLB(passive lysis buffer)裂解液裂解细胞,采用Promega的双荧光素酶报告系统检测萤火虫荧光素和海肾荧光素活性,计算相对活性。免疫组化胰腺癌癌组织及癌旁正常组织经10%中性福尔马林固定后,进行石蜡包埋,随后进行组织切片。切片(4μm厚)经脱蜡脱水后进行免疫组化染色。染色前先进行0.75%H2O2处理30 min,封闭内源性过氧化物酶活性。H2O2处理完成后,采用5%胎牛血清封闭,随后进行一抗anti-Hu R(1:300)染色,孵育24 h后,PBS洗涤三次,随后孵育二抗,最后DAB显色。统计分析所有结果按均值±SD表示。采用Student t检验或者one-way ANOVA分析组间差别。p<0.05视为有统计学差别。研究结果肾上腺素通过β2受体促进胰腺癌转移与先前文献报道一致,我们发现PANC-1细胞高表达β1和β2受体。肾上腺素处理剂量依赖地促进细胞迁移,与此同时,细胞E–cadherin的表达降低,而Vimentin表达增加。上述研究表明,肾上腺素通过EMT的方式促进细胞迁移。β2肾上腺素受体阻断剂ICI 118,551阻断该通路后,肾上腺素介导的细胞迁移及基因表达变化均被阻断,而ICI 118,551单独处理对细胞影响不大。上述研究表明,肾上腺素通过β2受体促进胰腺癌转移。β2受体信号通路激活TGFβ信号采用3×SBE荧光素酶报告系统监测TGFβ活性。肾上腺素可以诱导SBE报告系统读数约3倍的增高,而ICI 118,551可以阻断上述变化。与此一致,肾上腺素可以显著增加Smad2和Smad3的磷酸化水平,而整体表达水平基本不变;ICI 118,551则阻断上述肾上腺素对Smad2和Smad3的磷酸化作用。上述研究结果表明肾上腺素可以激活TGFβ信号通路。β2肾上腺素受体通路通过诱导Hu R胞浆转位激活TGFβ亚细胞组分分离后WB检测发现,肾上腺素可以促进Hu R的细胞浆转运,而ICI 118,551则阻止肾上腺素诱导的Hu R胞浆转运。此外,干涉Hu R表达后显著降低Hu R的表达,与此同时,肾上腺素诱导的SBE读数增高和Smad2/3的磷酸化也被抑制。Hu R在肾上腺素促进PANC-1转移中发挥关键作用与对照相比,干涉Hu R本身可以微弱降低细胞的迁移。当联合肾上腺素处理后,干涉Hu R则显著抑制肾上腺素诱导的细胞迁移。Hu R干涉抑制肾上腺素诱导的细胞迁移的效应和β2肾上腺素受体阻断剂ICI 118,551以及TGFβ抑制剂SB43152相近。对临床样本Hu R表达发现,Hu R的表达水平和临床胰腺癌的转移具有高相关性。临床样本分析证实肾上腺素-Hu R-TGFβ调控轴的存在临床样本研究发现,胰腺癌患者肾上腺素水平增高(27.55±8.55 pg/m L vs93.67±50.89 pg/m L),且增高的肾上腺素与患者预后负相关(高肾上腺素的患者中位生存期为9.6月,而低肾上腺素的为16.6月)。与癌旁组织相比,胰腺癌中Hu R表达水平略微增加,细胞浆中定位增加。统计分析发现,患者血清中肾上腺素水平和肿瘤组织中TGFβ水平正相关。上述研究提示胰腺癌演变过程中,的确存在肾上腺素-Hu R-TGFβ调控轴。结论我们发现:神经递质肾上腺素可以以剂量依赖的方式促进胰腺癌细胞PANC-1转移。ICI118,551阻断β2-肾上腺素受体可以显著减少细胞转移,表明β2-肾上腺素受体活化是肾上腺素促进细胞转移的主要受体。在分子机制方面,我们发现肾上腺素可以引起RNA结合蛋白Hu R细胞浆转位,进而活化TGFβ信号。干涉Hu R或者阻断TGFβ信号均可以阻断肾上腺素的促细胞迁移功能。综上,我们的研究表明肾上腺素–Hu R–TGFβ调控轴参与压力条件下胰腺癌细胞转移,靶向干预这条通路有望改善胰腺癌的转移。