【摘 要】
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目的:上皮性卵巢癌作为女性生殖系统死亡率最高的恶性肿瘤,其标准治疗方案为肿瘤细胞减灭术联合铂类为基础的一线化疗。紫杉醇作为一线化疗药物,其耐药的发生是导致患者复发和死亡的重要原因,但其确切耐药机制仍需进一步探索。为阐明紫杉醇耐药机制,我们应用覆盖人全基因组的siRNA文库快速筛选获得紫杉醇耐药上皮性卵巢癌细胞,并以该耐药细胞株为模型通过高通量测序以及数据挖掘等方式探索其紫杉醇耐药机制,为上皮性卵巢
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目的:上皮性卵巢癌作为女性生殖系统死亡率最高的恶性肿瘤,其标准治疗方案为肿瘤细胞减灭术联合铂类为基础的一线化疗。紫杉醇作为一线化疗药物,其耐药的发生是导致患者复发和死亡的重要原因,但其确切耐药机制仍需进一步探索。为阐明紫杉醇耐药机制,我们应用覆盖人全基因组的siRNA文库快速筛选获得紫杉醇耐药上皮性卵巢癌细胞,并以该耐药细胞株为模型通过高通量测序以及数据挖掘等方式探索其紫杉醇耐药机制,为上皮性卵巢癌的治疗寻求新的靶点。方法:将美国芝加哥大学医学中心Molab实验室成功构建并对文库多样性及覆盖率均已验证可覆盖人全基因组的pSOK-N29文库质粒包装成逆转录病毒后,感染紫杉醇敏感上皮性卵巢癌细胞株OVCAR8,然后通过致死剂量紫杉醇逐步筛选并建立耐药卵巢癌细胞株,验证该耐药细胞株耐药表型,然后提取不同紫杉醇浓度筛选的耐药细胞基因组DNA,特异性扩增出包含29个碱基的片段用于Illumina Hi Seq平台测序,期望获得富集片段并进一步研究其功能。利用Tq-PCR检测耐药细胞中耐药相关基因的表达,发现MAPK信号通路异常激活,为探索其耐药机制,我们通过体内和体外实验探讨MAPK信号通路中BRAF抑制剂维罗非尼联合紫杉醇对耐药卵巢癌细胞治疗效果。应用数据挖掘技术预测筛选11个与紫杉醇耐药相关的基因,利用Tq-PCR技术检测以上基因在亲代及耐药细胞以及耐药动物组织中的m RNA表达水平,发现IL13RA1在细胞和组织水平表达均增高,进一步沉默该基因后通过体内及体外实验探讨其对上皮性卵巢癌紫杉醇耐药表型及耐药机制。结果:1.在2%浓度血清培养条件下,紫杉醇作用于OVCAR8的致死量为20nM。2.使用致死剂量的紫杉醇和BSD进行双重筛选,成功获得耐药细胞后逐渐增加紫杉醇剂量,与亲代细胞OVCAR8相比,耐药细胞OVCAR8-N29耐药性增加200倍。3.体外实验发现,对比亲代细胞,耐药细胞对紫杉醇耐药性增强,具有更强的迁徙和增殖能力;紫杉醇作用后耐药细胞被阻滞在G2/M期细胞比例降低,细胞凋亡率降低。4.使用Tq-PCR检测OVCAR8亲代细胞及文库筛选耐药细胞OVCAR8-N29在DMSO及低浓度紫杉醇作用后耐药相关基因的表达变化,发现多重耐药基因、EMT相关基因、促生存信号通路相关基因、细胞自噬相关基因以及凋亡调控基因等在低浓度紫杉醇作用后的OVCAR8-N29细胞中表达水平变化明显,MDR1、VIM、TIMP1、BRAF、ULK1、p53和Bcl-2基因表达水平显著增高,而CDH1、ZEB1、PTEN、PI3KCA、Vps34表达水平显著降低。5.成功提取不同浓度紫杉醇耐药的卵巢癌细胞株基因组DNA并特异性扩增出包含有29个碱基片段的序列送至Illumina Hi Seq平台测序。6.体外实验发现紫杉醇联合维罗非尼可增加耐紫杉醇上皮性卵巢癌细胞OVCAR8-N29和Hey A8-MDR对紫杉醇敏感性,联合用药后耐药细胞凋亡率显著增加。7.动物实验提示紫杉醇联合维罗非尼处理耐药细胞Hey A8-MDR后肿瘤增殖率及肿瘤质量均较其他组降低。8.数据挖掘预测11个与紫杉醇耐药相关基因LAMB1,FAM114A1,CUEDC1,TM4SF1,PPIC,SNX7,IL13RA1,BRCA1,SLC35F5,TNFRSF12A,TRNP1,经Tq-PCR检测发现IL13RA1基因在细胞和动物肿瘤组织中表达水平显著增高。9.沉默IL13RA1后,结晶紫染色和WST-1细胞毒性实验发现耐药卵巢癌细胞OVCAR8-N29和Hey A8-MDR对紫杉醇敏感性增加,细胞周期分析发现Hey A8-MDR细胞被阻滞于G2/M期比例增加;凋亡分析显示细胞凋亡率显著增加。同时划痕实验和WST-1增殖实验发现沉默该基因后OVCAR8和Hey A8细胞的迁移能力和增殖能力下降。10.体内实验发现,与对照组相比,沉默IL13RA1后耐药细胞Hey A8-MDR的成瘤能力及增殖活性降低,而亲代Hey A8细胞肿瘤质量减轻。11.耐药机制检测发现对比亲代细胞,在耐药细胞中沉默IL13RA1后,STAT6和p53 m RNA表达水平下降,14-3-3表达上调。结论:本研究将含有pSOK-N29 siRNA文库的逆转录病毒导入紫杉醇敏感卵巢癌细胞OVCAR8,以致死剂量紫杉醇快速筛选建立耐药细胞,并应用结晶紫染色、WST-1检测、流式细胞术、凋亡分析等证实其耐药表型,Tq-PCR发现耐药机制可能与MDR1过表达、MAPK/ERK信号通路异常活化、EMT、IL13RA1参与的JAK/STAT6信号通路及下游凋亡和细胞周期调控等机制相关。维罗非尼联合紫杉醇对耐药上皮性卵巢癌治疗具有协同作用。
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