中药防治鸭疫里氏杆菌病的组方筛选及其抗菌机制的初步研究

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鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer,Ra)病,也称鸭传染性浆膜炎,是鸭的一种细菌性传染病。该病以纤维素性心包炎、气囊炎、肝周炎、输卵管炎、关节炎、脑膜炎等为主要病变特征,广泛分布于世界各养鸭国家和地区,主要危害8周龄以内的小鸭,3~4周龄的小鸭最易感染,死亡率最高可达70﹪,是造成养鸭业严重损失的主要传染病之一。Ra菌有21个血清型,不同血清型之间缺乏交叉保护能力,且Ra对各类抗生素极易产生耐药性,在很多地区已经难以找到对Ra敏感的药物。因此,本课题探索采用中药防治鸭疫里氏杆菌病,并初步研究了其抗菌机制。 遵循中医学辨证施治原则,根据鸭疫里氏杆菌病的临床症状和病理表现,共选择中药25昧,从中组方4个,同时使用单味药7个。将单味中药和各组方的水煎剂采用纸片扩散法进行抗鸭疫里氏杆菌病的体外抑菌试验;采用将小鸭人工发病,再以饮水法给药,进行体内治疗试验。结果显示,黄连药敏纸片对I型、II型Ra细菌均具有极好的体外抑菌效果,但对人工发病后的小鸭无治疗效果;黄柏具有轻微的体外抑菌效果;4个组方中仅有“黄连浆膜炎汤”(CISD)在体外具有良好的抑菌效果,最小抑制鸭疫里氏杆菌的生药浓度为0.088×2—4pdml,完全抑制鸭疫里氏杆菌增殖的生药浓度为0.088×2~g/ml,药物抑制细菌增殖效果和药物浓度呈正相关;其对人工发病鸭的有效治疗药物浓度为0.088×2—2g/ml,存活率达到90﹪,而对照组的耐过率为52﹪,两者相比药物治疗效果十分显著。 在筛选出防治RA病药物的基础上,研究了黄连浆膜炎汤(CoptidisrhizomaInfectiousSerositisDicoction,CISD)对鸭疫里氏杆菌的体外最小抑制浓度,在亚抑菌浓度下用电镜观察了细菌的形态变化。将CISD水提醇沉后,减压浓缩,倍比稀释制成0.088g/mi,0.088×2一~g/ml,0.088×2—2g/mi……0.088×2一l~g/ml等梯度浓度,以纸片扩散法和试管法测定CISD的最小抑菌浓度,用紫外可见分光光度计在600nm波长下测定试管肉汤的OD值;取0.088g/mi和0.088×2—3g/ml药物浓度组分别作用17h和3、6、17h后的细菌在透射电镜下进行形态观察。结果:无论纸片法还是试管法均在0.088×2—4g/ml浓度组下为最小抑制浓度;药物作用后细菌菌体完整,但长度变长,菌内皱褶减少,纹理变得不均匀,部分区域隆起,有些细菌发生卷曲或折叠等。药物可能通过破坏细菌结构达到抑制细菌增殖的目的。 同时研究了CISD在体内外对鸭淋巴细胞增殖的影响,从免疫学角度研究其治疗RA病的作用机理。采用MTT法,在鸭体内外给药后,用酶标仪在570nm下测定各试验和对照组C02箱培养后的淋巴细胞吸光值。结果显示,小鸭体内给药2d后,CISD单独或对由ConA和PMA刺激的鸭脾脏、法氏囊淋巴细胞增殖均无影响(P>0.05);体外给药,在3个浓度范围内,CISD单独或对由PMA诱导的鸭脾脏B淋巴细胞增殖产生抑制作用(尸<0.05),对ConA诱导的脾脏T淋巴细胞增殖作用无影响(P>0.05);CISD体外单独给药或合并PMA和ConA,对鸭法氏囊淋巴细胞增殖无影响(尸>0.05)。以上结果表明,CISD在体外不仅能够单独抑制鸭脾脏B淋巴细胞增殖,而且抑制由ConA或PMA诱导的淋巴细胞增殖作用,尤其对PMA诱导的淋巴细胞增殖抑制作用显著。CISD抑制鸭淋巴细胞增殖,进而通过抑制由淋巴细胞分泌的炎性细胞因子增殖途径达到减轻鸭病理和临床症状的目的,起到治疗保护的作用。 在实验室研究的基础上进行了野外临床试验。证实CISD对临床发病鸭具有显著的治疗效果;同时,对大肠杆菌引起的浆膜炎也有治疗作用,初步显示是一种广谱抗菌药物。在鸭发病期间,在同一鸭场提前给健康鸭服药具有预防本病发生的作用。
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