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目的：耐药现象是影响胶质瘤化疗效果的重要原因,与相关耐药基因的异常表达有关。明确耐药基因与常用化疗药物之间的关系,并以此为靶点,通过调节基因的功能,增加化疗敏感性,从而实现耐药逆转,是目前研究的热点问题。本研究通过人脑胶质瘤U251细胞对替莫唑胺(TMZ)和卡莫司汀(BCNU)化疗耐药的研究,分析耐药产生的机理,探讨维拉帕米(VRP)对化疗耐药逆转的敏感性。方法：本研究分为四个部分。①胶质瘤U251细胞对TMZ和BCNU耐药性分析：TMZ终浓度(单位：g／L)为0.00625,0.0125,0.025,0.05,0.1,0.2；BCNU终浓度(单位：g／L)为0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5。细胞活性用MTT测定,细胞周期用流式细胞仪检测。②U251细胞对TMZ和BCNU多药耐药机理研究：细胞活性通过MTT来测定,细胞周期通过流式细胞仪测定；耐药蛋白通过Western-blot和免疫组化检测。③维拉帕米对U251细胞化疗耐药逆转的体外研究：细胞活性用MTT测定,细胞周期用流式细胞仪来检测；化疗前后耐药蛋白通过Western-blot和免疫组化检测。④维拉帕米对U251细胞化疗耐药逆转的体内研究：建立U251细胞裸鼠皮下模型,肿瘤用游标卡尺测量最大径和最短径。BCNU组剂量为25mg／kg,腹腔注射,每周一次,连续2周；BCNU+维拉帕米组,先给维拉帕米4mg／kg,5min后给BCNU,剂量和给药方式与BCNU组相同。用免疫荧光染色测定P-gp、MRP1、LRP基因表达。结果：①胶质瘤U251细胞对TMZ和BCNU耐药性分析：TMZ初始耐药浓度为0.05g／L,初始耐药时间为第3天。BCNU初始耐药浓度为0.2 g／L,初始耐药时间为第2天。与空白对照组比较,TMZ和BCNU组中,处于G0／G1期细胞明显增多(P<0.05)。②U251细胞对TMZ和BCNU多药耐药机理研究：U251细胞对BCNU和TMZ产生耐药现象；与空白对照组比较,BCNU和TMZ能诱导U251细胞被阻滞于G0／G1期；Western-blot检测显示,与空白对照组比较,相关耐药基因P-gp,MRP1,LRP表达均增加,其中P-gp,MRP1蛋白水平有统计学差异(P<0.05),MGMT在BCNU中表达增加,TMZ组中表达减少。免疫组化检测显示,使用BCNU前,LRP为阳性,P-gp和MRP为阴性。使用BCNU后,LRP仍为阳性,P-gp为弱阳性,MRP1为阳性。③维拉帕米对U251细胞化疗耐药逆转的体外研究：VRP对TMZ和BCNU作用U251细胞在某些时间点(BCNU在第3天,TMZ在第2、5、7天)有统计学差异(P<0.05)；VRP+TMZ、VRP+BCNU组与TMZ、BCNU比较,可以有效的将细胞抑制在G0／G1期(P<0.05)；Western-blot检测显示,与空白对照组比较,VRP组中基因P-gp、MRP1、MGMT表达减少；与TMZ、BCNU比较,VRP+TMZ、VRP+BCNU中P-gp、MRP1、MGMT表达减少,两组中P-gp、MRP1比较分别有统计学差异(P<0.05)；与TMZ比较,VRP+TMZ中LRP增加,与BCNU比较,VRP+BCNU中LRP减少。免疫组化检测显示,加入VRP后,耐药基因P-gp,MRP1,LRP的表达无明显改变。④维拉帕米对U251细胞化疗耐药逆转的体内研究：与BCNU比较,BCNU+VRP在第1、2、3、4周有统计学差异(P<0.05)。免疫荧光染色检测显示,与BCNU比较,VRP+BCNU基因表达LRP阳性,P-gp,MRP1为弱阳性。结论：①不同化疗药物不同浓度和作用时间对U251细胞化疗具有不同的敏感性；②化疗药物通过对细胞周期的影响使胶质瘤产生耐药；③耐药基因表达量和表达类型的改变,尤其是P-gp、MRP1,是多药耐药产生的原因之一,胶质瘤的多药耐药现象是通过原发性和继发性耐药共同作用的结果；④体内外的实验表明,维拉帕米对TMZ、BCNU化疗胶质瘤具有一定的协同作用,维拉帕米可以竞争性的与膜上的耐药蛋白P-gp、MRP1结合,来逆转胶质瘤多药耐药的现象,通过抑制耐药基因P-gp、MRP1的表达来增加TMZ、BCNU的敏感性。