第一部分SSc患者Th17和Treg细胞亚群及相关细胞因子的研究目的研究Th17和Treg细胞亚群在系统性硬皮病(Systemic scleroderma, SSc)患者外周血中的变化情况,观察治疗前后该细胞的变化,探讨其在SSc发病中的可能作用。方法35例SSc患者和22例正常对照者用流式细胞仪检测外周血中Th17、Treg细胞各占CD4+细胞的百分比,其中10例SSc患者经治疗1月后再次流式检测Th17、Treg细胞水平。20例SSc患者和16例正常对照者用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测外周血清中IL-17、IL-21、IL-22的表达情况；用荧光定量PCR (real-time PCR)法检测外周血单个核细胞(PBMC)中IL-17、IL-21、IL-22 mRNA的表达情况。结果(1)SSc患者外周血中Th17细胞占CD4+细胞的百分比(1.29±0.84),较正常人组(0.57±0.24)显著增高,有统计学差异(P<0.05)。SSc患者外周血中Treg细胞占CD4+细胞的百分比(6.36±3.33),较正常人组(9.15±2.91)显著降低,差异也具有统计学意义(P<0.05)。其中10例SSc患者经治疗1月后,再次检测Thl7细胞所占百分比为(0.78±0.25),较治疗前降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。治疗后Treg细胞百分比为(7.14±3.60),与治疗前比较无显著性差异(P>0.05)。(2)SSc患者和正常人血清中IL-17的浓度分别为(50.30±20.23) pg/ml和(20.48±5.69) pg/ml,两组间比较有显著性差异(P<0.05)、IL-21、IL-22的浓度两组间比较均无显著性差异(P>0.05)。SSc患者和正常人外周血PBMC的IL-17 mRNA表达水平分别为18.72±2.01、7.59±0.84,两组间比较有显著性差异(P<0.05)。SSc患者和正常人PBMC的IL-21 mRNA表达水平分别为15.99±1.50、10.83±0.97,两组间比较有显著性差异(P>0.05)。IL-22 mRNA表达水平分别为23.76±3.87、24.53±4.64,两组间比较无显著性差异。结论SLE患者外周血中存在Th17细胞亚群的改变,可能与SSc的发病相关。第二部分SSc患者外周血PBMC对成纤维细胞高胶原合成克隆胶原合成的影响及IL-17单抗的干预作用目的分离培养SSc患者皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblast, HDF)克隆,筛选出高胶原合成克隆。分选SSc患者和正常人外周血PBMC,检测其对成纤维细胞克隆的影响。方法SSc患者皮肤Fb采用组织块法原代培养,改良的有限稀释法分离Fb克隆,通过荧光定量PCR法检测Fb克隆Ⅰ型前胶原a1链(COL1A1) mRNA的表达。筛选高胶原合成成纤维细胞克隆。密度梯度离心法分离SSc患者和正常人各10例外周血PBMC,经PMA、Ionomycin刺激5h后上清液与成纤维细胞克隆共培养。ELISA检测上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白水平变化,荧光定量PCR检测单克隆细胞胶原mRNA合成的变化。并研究加入IL-17单抗后,胶原表达的变化。结果建立3个SSc患者皮肤Fb细胞系,经分离、培养共获得32个Fb克隆。通过聚类分析将所有克隆的CT值分为高、中、低三组,选取8个高胶原合成克隆做后续试验。ELISA检测与SSc患者和正常人PBMC上清液共培养的Fb克隆Ⅰ型胶原浓度分别为(186.13±30.07) ng/ml、(55.86±15.47) ng/ml,差异具有统计学意义(P<0.05)。Ⅲ型胶原浓度分别为(156.44±35.19) ng/ml、(74.62 ±26.16) ng/ml,差异也具有统计学意义(P<0.05)。荧光定量PCR检测与SSc患者和正常人PBMC上清液共培养的Fb克隆Ⅰ型胶原表达水平分别为12.29±1.71、6.75±1.28,两组间比较有显著性差异(P<0.05)。Ⅲ型胶原表达水平分别为10.94±2.34、6.22±1.50,两组间比较也有显著性差异(P<0.05)。加入IL-17单抗后,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达均有所降低。结论SSc患者的PBMC细胞培养上清可增加HDF克隆胶原基因的表达,参与SSc的发病过程。通过拮抗IL-17的功能可以部分阻断SSc患者PBMC细胞的促成纤维细胞胶原合成作用,提示IL-17对SSc患者HDF胶原合成有促进作用。第三部分 SSc患者Th17和Treg细胞对成纤维细胞高胶原合成克隆胶原合成的影响目的分选系统性硬皮病患者和正常人的外周血Th17、Treg细胞,检测其对成纤维细胞高胶原合成克隆的影响。方法进展期SSc患者和正常对照者各5例分离外周血PBMC,流式细胞仪分选Th17、Treg细胞。分别与之前获得的成纤维细胞高胶原合成克隆共培养。ELISA方法检测细胞培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白水平变化,荧光定量PCR法检测单克隆细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA合成的变化。结果与SSc患者和正常对照组Th17细胞共培养的单克隆成纤维细胞上清液中Ⅰ型胶原浓度分别为(120.29±11.53)ng/ml、(50.45±6.40)ng/ml,两组间比较有显著性差异(P<0.05)。Ⅲ型胶原浓度分别为(97.63±9.88)ng/ml、(65.64 ±8.76)ng/ml,两组间比较也有显著性差异(P<0.05)。与SSc患者和正常对照组Th17细胞共培养的单克隆成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达水平分别为9.54±0.97、6.26±1.25,差异具有统计学意义(P<0.05)。Ⅲ型胶原mRNA表达水平分别为8.53±1.45、5.45±2.82,差异具有统计学意义(P<0.05)。与SSc患者和正常对照组Treg细胞共培养的单克隆成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平均无明显差异(P>0.05)。结论SSc患者的Th17细胞可增加成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达,该细胞可能在SSc发病中起一定作用。第四部分IL-17对SSc患者成纤维细胞胶原合成的影响目的检测IL-17对SSc患者皮肤成纤维细胞高胶原合成克隆胶原合成的影响,并探讨其可能的机制。方法IL-17与高胶原合成HDF克隆共培养72h, MTT法绘制生长曲线。IL-17(20ng/ml)与HDF克隆共培养后,荧光定量PCR法检测克隆细胞Ⅰ型前胶原、IL-17R及粘附分子ICAM-1 mRNA表达,并研究加入IL-17单抗(20ug/ml)后,Ⅰ型胶原和相关因子表达的变化。结果成纤维细胞克隆与IL-17共培养组较未加IL-17组细胞增殖速度加快,细胞倍增时间缩短。空白组、与IL-17共培养组、与IL-17+IL-17单抗共培养组HDF I型胶原mRNA表达水平分别为8.71±2.72、12.50±2.19、10.53±2.28,三组间比较均有显著性差异(P<0.05)。 IL-17R mRNA表达水平分别为10.74±1.32、15.69±2.08、11.99±1.58,其中与IL-17组相比,空白组和IL-17+IL-17单抗组均有显著性差异(P<0.05),但后两者之间无显著性差异(P>0.05)。ICAM-1mRNA表达水平分别为18.66±2.17、24.59±3.72、21.14±3.06,三组间比较均有显著性差异(P<0.05)。结论IL-17可增加SSc患者的皮肤成纤维细胞增殖和胶原合成,加入IL-17单抗可降低上述作用。