四个卵巢癌候选致病基因的细胞功能研究

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研究背景和目的:卵巢癌(ovarian cancer,OC)是女性常见的五大癌症之一,并且是导致女性死亡的第一大生殖系统癌症。据统计,约有20%~25%卵巢癌的发生发展与遗传因素有关。晚期卵巢癌患者5年生存率仅为25%~40%。根据课题组前期的全外显子测序和sanger测序结果,本实验在TP53、PTEN、CREBBP和NOTCH2基因中筛选出了7个点突变,通过对致病候选基因TP53、PTEN、CREBBP和NOTCH2基因及其突变进行细胞功能性实验,探讨这4基因及其7个点突变对卵巢癌细胞蛋白表达、增殖、迁移及侵袭的影响。研究方法:选择无内源性TP53、CREBBP和NOTCH2蛋白表达的卵巢癌A2780细胞系进行该基因的细胞实验,选择无内源性PTEN蛋白表达的卵巢癌CAOV3细胞系进行该基因的细胞实验。每个基因组各分为野生型组、突变型组和空载体组。构建TP53、PTEN、CREBBP和NOTCH2基因的野生型质粒,利用点突变试剂盒构建筛选到的TP53 G199X、TP53 V157fs、PTEN H122D、PTEN Q22X、CREBBP L1850fs、CREBBP P1373S和NOTCH2 P2113S 7个点突变的质粒,利用脂质体转染法分别转染至A2780和CAOV3细胞系中,(1)采用Western blotting法检测各个基因组的突变型组对卵巢癌细胞蛋白表达的影响;(2)采用CCK-8实验方法检测各个基因组的野生型组和突变型组对卵巢癌细胞增殖情况的影响;(3)采用划痕实验检测各个基因组的野生型组和突变型组对卵巢癌细胞迁移情况的影响;(4)采用Transwell细胞侵袭实验检测各个基因组的野生型组和突变型组对卵巢癌细胞侵袭情况的影响;(5)采用双荧光素酶检测实验检测NOTCH2野生型组和P2113S突变型组对Notch信号通路活性的影响。研究结果:(1)Western-blot实验表明:PTEN H122D、CREBBP P1373S和NOTCH2 P2113S突变不影响蛋白表达,而TP53 G199X、TP53 V157fs、PTEN Q22X和CREBBP L1850fs突变无法正常表达蛋白。(2)过表达野生型TP53、PTEN或CREBBP均能抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而过表达突变型TP53、PTEN或CREBBP能促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,然而过表达野生型或突变型NOTCH2均能促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。(3)NOTCH2野生型组和P2113S突变型组卵巢癌细胞中荧光素酶活性与空载体组相比显著增加,且NOTCH2 P2113S突变型组卵巢癌细胞中CBF1的启动子活性与野生型组相比显著降低。研究结论:通过细胞实验,表明筛选出的错义突变均不影响蛋白的表达,而无义突变和移码突变均可造成蛋白缺失。野生型TP53、PTEN和CREBBP可抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而TP53、PTEN、CREBBP和NOTCH2所有突变型及NOTCH2野生型会增强本实验中所使用的卵巢癌细胞的恶性程度。NOTCH2 P2113S突变型仅部分激活了A2780卵巢癌细胞的Notch信号通路。
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