论文部分内容阅读
乳腺癌是严重威胁女性生命健康的最常见恶性肿瘤之一。膳食因素在乳腺癌的发生与演进过程中起着重要作用,其中大豆及其制品对乳腺癌的保护作用研究备受关注,并认为大豆中的植物化学物成分大豆异黄酮(soy isoflavones,SI)是其保护作用的主要活性成分。SI包括染料木黄酮(genistein,GEN)和大豆苷元(daidzein,DAI)两种主要成分,其分子结构特征与人体内源性的雌激素结构非常相似,可与核受体超家族成员中的雌激素受体(estrogen receptor,ER)结合,从而具有模拟雌激素作用和拮抗雌激素作用的双重调节活性,被称为“植物雌激素”。近年来,国内外学者对SI的抗乳腺癌作用进行了大量的动物实验和体外实验研究,结果显示SI具有以下抗肿瘤作用:(1)阻滞细胞周期进程,抑制肿瘤细胞增殖;(2)诱导肿瘤细胞凋亡;(3)抑制肿瘤细胞侵袭转移;(4)抑制肿瘤血管形成,降低肿瘤微血管密度(Microvessel density,MVD)阻止肿瘤生长。目前认为SI抗乳腺癌作用的靶基因主要包括cyclin B、p21、p16、Bax、Bcl-2、NF-κB、Akt、MMPs等,但SI调节这些靶基因表达的分子机制尚未完全阐明。过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)属于核受体超家族成员之一。PPARs包括PPARα、PPARβ和PPARγ3个亚型,PPARs作为配体依赖性激活的核转录调节因子结合相应的配体后被激活,并与靶基因启动子上的过氧化物酶体增殖物反应元件(Peroxisome proliferator response element,PPRE)结合,从而调控靶基因的表达水平,参与细胞生理功能调节。近年研究发现,大多数肿瘤细胞都存在PPARγ表达,PPARγ与肿瘤的关系开始受到广泛关注。大量体内外实验研究结果表明,一些PPARγ配体如罗格列酮(rosiglitazone,ROS)等格列酮类药物、前列腺素代谢物15-d-PGJ2对乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、胃癌等多种器官来源的肿瘤具有明显的抗肿瘤作用,因此PPARγ被认为是肿瘤治疗的新靶点,PPARγ配体可能是潜在的肿瘤化学防治药物。已有初步研究证实,SI可作为PPARγ的天然配体。SI的抗乳腺癌作用是否与PPARγ信号途径有关尚不清楚。基于以上分析,本研究选择人乳腺癌细胞株MCF-7细胞作为实验对象,采用免疫细胞化学染色、PPRE驱动的荧光素酶报告基因检测、CCK-8比色法、细胞周期分析、蛋白免疫印迹(Western blot)等技术方法,首先观察人乳腺癌MCF-7细胞PPARγ的表达情况,以及GEN、DAI和ROS(作为阳性对照)对MCF-7细胞PPARγ的激活作用,然后比较GEN、DAI和ROS单独或联合PPARγ特异性拮抗剂GW9662处理MCF-7细胞后,细胞增殖能力和细胞周期,以及细胞增殖调控相关基因PTEN、cyclinB、cyclinD1、p21等蛋白表达水平的变化,以期探讨PPARγ信号途径在大豆异黄酮抑制乳腺癌细胞增殖中的作用。主要研究结果和结论如下:1.PPARγ免疫细胞化学染色结果显示,乳腺癌MCF-7细胞的胞浆和胞核中均可见有棕黄色或棕褐色的着色颗粒,且着色颗粒主要分布于细胞浆中。结果表明,乳腺癌MCF-7细胞存在有PPARγ表达。2.PPRE驱动的荧光素酶报告基因检测分析结果显示,GEN、DAI和ROS均可明显增强乳腺癌MCF-7细胞的荧光素酶报告基因表达活性(p<0.05),而PPARγ特异性抑制剂GW9662可明显逆转GEN、DAI和ROS对MCF-7细胞的荧光素酶报告基因表达活性的增强作用。结果表明,GEN、DAI和ROS均可激活乳腺癌MCF-7细胞的PPARγ信号途径。3.CCK-8比色法检测细胞增殖能力的结果显示,8×10-5 mol/L的GEN、DAI和1×10-5 mol/L的ROS均可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖(p<0.05),并存在时间依赖性效应。PPARγ特异性抑制剂GW9662明显削弱GEN、DAI和ROS对MCF-7细胞增殖的抑制作用(p<0.05)。结果表明,GEN、DAI和ROS对MCF-7细胞增殖的抑制作用与其激活PPARγ信号途径有关。4.流式细胞检测分析结果显示,GEN、DAI处理乳腺癌MCF-7细胞可导致G2/M期阻滞,而ROS处理则引起细胞阻滞于G0/G1期。PPARγ特异性抑制剂GW9662明显减弱GEN、DAI和ROS对MCF-7细胞周期的阻滞作用(p<0.05)。结果表明,GEN、DAI和ROS可通过激活MCF-7细胞的PPARγ信号途径,引起细胞周期阻滞。5.蛋白免疫印迹检测分析结果显示,GEN、DAI和ROS均可明显增加乳腺癌MCF-7细胞PTEN、p21蛋白表达水平,GEN和DAI明显降低cyclinB、cyclinD1蛋白表达水平,而ROS仅显著降低cyclinD1蛋白表达水平。PPARγ特异性抑制剂GW9662明显削弱GEN、DAI和ROS对MCF-7细胞PTEN、cyclinB、cyclinD1、p21等蛋白表达水平的增加或降低作用。结果表明,GEN、DAI和ROS可通过激活MCF-7细胞的PPARγ信号途径,引起细胞增殖调控相关基因的蛋白表达水平发生明显变化。以上结果提示,人乳腺癌MCF-7细胞存在PPARγ表达,SI的两种主要成分DEN和DAI可激活MCF-7细胞的PPARγ信号途径,引起细胞增殖调控相关基因PTEN、cyclinB、cyclinD1、P21等蛋白表达水平发生明显变化,导致G2/M期阻滞,进而抑制MCF-7细胞增殖。本实验研究结果初步证实PPARγ信号途径激活是介导SI抗乳腺癌作用的分子机制之一。