研究背景慢性HBV感染一直是危害全球人民健康的主要致病因素之一。近年来，有关其发病机制取得了多方面的进展，同时也进一步暴露出若干重要问题需要加以深入研究。由于HBV感染的宿主谱较窄，且缺乏稳定的体外感染的细胞培养系统，因此束缚了其致病机制的研究。一般情况下，HBV本身并不直接导致肝细胞损害，而大量淋巴细胞浸润肝脏提示T细胞免疫与慢性乙型肝炎(CHB)肝细胞的损伤密切相关。特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答是机体清除肝细胞内HBV感染的主要机制之一。HBV在体内清除的机制涉及诸多方面的重要因素，包括宿主的免疫遗传学背景、感染的HBV病毒学背景等；而体内特异性CTL的种类及活化程度则是这两方面的交叉和综合体现。研究发现，乙型肝炎病毒(HBV)特异性T淋巴细胞表位(epitope)，是特异性细胞免疫应答得以激发的重要原动力，处于免疫识别和免疫激活的核心位置。HLA-A*0201限制性HBV特异性CTL表位HBcAg18-27(FLPSDFFPSV，简记为C18-27V)被认为是HBV CTL表位研究中的最为经典的序列，是目前被引用最多的HBV表位肽，并常在乙型肝炎细胞免疫学研究中作为慢性感染的阳性参照。然而，在C18-27V的引用过程中，研究者多忽略了对该表位分子病毒学和分子免疫学背景的辨析。因此，研究我国HBV慢性感染患者中HLA-A四种主流等位基因A11、A2、A24和A33的分布，了解我国流行的HBV基因型B和C型毒株HBcAgl8-27V／I变异体的分布差异，探讨不同HLA-A2+慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T淋巴细胞的结合频数，明确HBcAgl8-27V／I变异体对慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞频数和功能状态的影响，可以为HBV CTL新表位的筛选提供更符合中国HBV病毒学和免疫学背景的阳性表位对照。研究目的1．通过了解我国华南地区慢性乙型肝炎患者主流HLA-A等位基因的分布特征，特别是HLA-A2、A11、A24、33在慢性乙型肝炎患者中的分布状况，为筛选中国不同HBV基因型HLA-A11、A33限制性CTL新表位提供重要的宿主遗传学背景，也是表位筛选研究的前提基础。2．通过了解我国不同地区HBV感染者不同基因型之间存在的HBcAg18-27V／I变异体的分布差别，与欧美等地区的HBV基因型发现的HLA-A2限制性表位HBcAg18-27V进行分子流行病学的对比，为中国HBV感染人群的CTL新表位筛选提供必要的病毒学背景，阐明病毒学差异对免疫学差异的影响，避免片面分析可能引起的谬误。3．通过比较18-27 V和18-27 I对HLA-A2分子的结合能力和诱导免疫应答能力的差异，了解HBcAg18-27V／I变异体与慢性乙型肝炎患者外周血中特异性淋巴细胞频数及功能的关系，为CTL新表位的筛选提供更符合中国国情的HBV病毒学和免疫学背景的阳性表位对照。研究方法1．以267例慢性乙型肝炎患者和300例健康献血员为研究对象，用离心柱型血液基因组DNA抽提试剂盒进行外周血染色体基因组DNA的提取，合成序列特异性的HLA-A11、A2、A24、A33引物，并以β-actin的基因扩增产物作为内参照物，运用序列特异性引物—聚合酶链式反应(PCR-SSP)法进行HLA-A11、A2、A24、A33等位基因检测型，应用SPSS10.0软件进行统计学分析。基因频率的计算采用直接计数法；组间对应等位基因频率的比较采用x~2检验，以P＜0.05为有显著性意义。2．应用分子生物学和生物信息学方法运用PCR扩增本室保存的中国8省市HBV基因型调查血清，每个地区选择血清20份，共160份。分析不同地区、不同HBV基因型、不同临床结局HBV感染者血清中HBV／C基因片段，测序分析HBcAg18-27特异性CTL表位碱基水平和氨基酸水平变异的情况；运用表位预测网站分析不同HBcAg18-27特异性CTL表位基因变构体与HLA-A2.1分子之间亲合力的影响。3．收集ALT≥2×ULN的慢性乙肝患者外周血淋巴细胞，通过PCR-RFLP法分析感染者的HBV基因型、HBcAg18-27V／I，PCR-SSP法分析HLA-A2基因型，应用以PE标记的四聚体(Tetramer)和FITC标记的CD8单克隆抗体双重标记淋巴细胞，用流式细胞仪分别检测HBcAg18-27V-Tetramer(+)／CD8(+)和HBcAg18-27I-Tetramer(+)／CD8(+)的淋巴细胞数。18-27V／I特异性T细胞的阳性率比较应用配对t检验，组间比较应用独立样本t检验，P＜0.05为有显著性意义。研究结果1．慢性乙型肝炎(CHB)组HLA-A11、A2、A24、A33的基因频率分别为57％、41％、21％、7％，以HLA-A11最常见。健康对照组四种HLA-A等位基因的频率分别为57％、46％、24％、14％，也以HLA-A11最常见。HLA-A33的频率在两组间有显著差异(x~2=7.556，P=0.006)。CHB组HLA-A2／A11、A2／A24、A2／A33、A11／A24、A11／A33、A24／A33的基因频率分别为17％、4％、1％、16％、4％、0.4％，健康人群则为18％、8％、4％、11％、5％、1％，各种基因组合的出现率在两组间近似。HBeAg(+)与HBeAg(一)CHB组比较，HLA-A11(x~2=3.324，P=0.072)、A2(x~2=0.324，P=0.569)、A24(x~2=0.308，P=0.579)、A33(x~2=1.159，P=0.282)等位基因的频率分布在两组间无显著性差异。2．我国北京、福建、广东、海南、湖南、山东、兰州、云南8省市HBV B、C基因型血清各80份，共发现HBcAg18-27V 3份，其余均为HBcAg18-27I。C18-27V在B基因型中为2.50％，在C基因型中为1.25％；C18-27I在B基因型中为97.50％，在C基因型中为98.75％。C18-27I占总调查样本的98.12％，而C18-27V仅占总调查样本的1.88％。可见，我国B、C基因型的V／I变异体均以C18-27I为主，两种表位变异体的构成比在基因型间并无显著差异(x~2=0.340，P=0.560)。在108例慢性活动性乙型肝炎患者血清中，B、C基因型各为54例，其中C型中有1例为C18-27V，其余为C18-27I；虽然两种基因型中C18-27V与C18-27I的分布率比较无显著差异(x~2=1.009，P=0.315)，但C18-27I的出现频率均显著高于C18-27V。e抗原阳性的标本中，B、C型分别为57和55例，C18-27V的例数分别为2和1例，两种基因型中C18-27V与C18-27I的构成比虽无显著差异(x~2=0.307，P=0.580)，但均以C18-27I为占绝对多数。3．广东地区慢性乙肝患者主要为HLA-A2基因型(22／44)；感染的HBV主要为B基因型(35／44)；其中HBcAg18-27为I变异体的占优势(43／44)。在43例C18-27I中，A2阳性组HBcAg18-27I-Tetramer(+)／CD8(+)的淋巴细胞频数比较HBcAg18-27V-Tetramer(+)／CD8(+)的淋巴细胞频数(0.52±0.31 VS 0.13±0.08)，差异有统计学意义(t=-6.914，P=0.000)。研究结论1．中国华南地区CHB患者的主要HLA-A等位基因均为HLA-A11、A2、A24及A33，以HLA-A11最为多见，这健康人群四种主流HLA-A等位基因的分布频率近似，提示鉴定HLA-A11限制性HBV特异性CTL新表位具有十分重要的意义。此四种等位基因及其组合模式与CHB患者的HBeAg状态无明显相关，但与HBV感染的其他临床特点及抗病毒治疗应答之间的关系有待研究。2．我国HBV感染株中HBcAg18-27表位主要为HBcAg18-27I，与欧美地区鉴定的经典HLA-A*0201限制性HBV特异性CTL表位HBcAg18-27V具有极为显著的分布差异。这一病毒学背景可能影响我国HBV感染者的特异性细胞免疫应答的强度，并可能与抗病毒治疗(特别是免疫调节治疗)效果方面的差异相关。3．在以HBcAg18-27I表位为主的HBV感染流行地区，应用HBcAg18-27V表位进行细胞免疫学研究欠妥，因其结果和结论可能产生相应偏差。