【摘 要】
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背景正常细胞通过葡萄糖代谢产生ATP为细胞提供能量。而在肿瘤细胞中,无论细胞内氧气量如何,细胞更依赖于糖酵解途径为细胞分裂供能,这种现象被称为瓦氏效应。同时肿瘤细胞还依赖线粒体进行新陈代谢,特别是谷氨酰胺酶分解代谢谷氨酰胺生成ATP和乳酸。谷氨酰胺酶（Glutaminase,GLS）是谷氨酰胺分解的关键酶,将谷氨酰胺转化为谷氨酸,谷氨酸再通过三羧酸循环进一步分解代谢产生ATP,GLS高表达对于肿瘤
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背景正常细胞通过葡萄糖代谢产生ATP为细胞提供能量。而在肿瘤细胞中,无论细胞内氧气量如何,细胞更依赖于糖酵解途径为细胞分裂供能,这种现象被称为瓦氏效应。同时肿瘤细胞还依赖线粒体进行新陈代谢,特别是谷氨酰胺酶分解代谢谷氨酰胺生成ATP和乳酸。谷氨酰胺酶（Glutaminase,GLS）是谷氨酰胺分解的关键酶,将谷氨酰胺转化为谷氨酸,谷氨酸再通过三羧酸循环进一步分解代谢产生ATP,GLS高表达对于肿瘤代谢表型至关重要。选择性多聚腺苷酸化（APA）是大多数人类基因调控中的普遍机制,约70%的人类基因有多个poly A结合位点,这些位点产生具有不同3’非翻译区（3’UTR）长度和含量的转录亚型。虽然蛋白质编码序列未改变,但由于去除远端3’UTR可能性降低m RNA的稳定性或出现损害翻译效率的调控元件,如micro RNA（mi RNA）结合域,进而影响基因的表达。在本研究,拟尝试通过分子生物学层面解释肿瘤细胞在代谢和能量利用方面的基因的转录后调节机制,为胃癌早期诊断和新的抗癌疗法提供理论基础。目的探究GLS在不同胃癌细胞中的APA发生情况及其引起的GLS的表达变化,探讨GLS 3’UTR差异与胃癌发生的相关性,以评估胃癌细胞中APA失调和GLS的差异表达作为胃癌诊断指标的可能性,为胃癌的诊断提供相应的理论基础。方法1.获取TCGA数据库中胃癌相关数据,并对TCGA数据库中415例胃癌组织及34例正常组织中GLS的表达进行分析。2.通过RT-q PCR检测不同胃癌细胞株中GLS的表达水平,利用Western blot检测GLS蛋白在胃黏膜上皮细胞株和胃癌细胞中的表达水平。3.通过3’RACE,对不同胃癌细胞株中GLS转录本进行扩增,并进行测序及分析。4.对不同GLS 3’UTR与mi RNA结合情况进行生物信息分析。然后选定并合成与多数GLS 3’UTR亚型结合的mi RNA-23、仅与GLS 3’UTR-1结合的mi RNA-302分别转染进GES,BGC-803,AGS细胞中,并通过RT-q PCR对转染后细胞内GLS的相对表达量进行检测。5.通过双荧光素酶报告基因实验评估mi RNA-23对不同GLS 3’UTR转录本的调控情况。结果1.与正常组织相比,胃癌组织中GLS的转录水平显著高。2.与正常胃黏膜上皮细胞株GES相比,BGC-803,AGS,MGC-803细胞中GLS的表达水平明显较高。3.4种细胞的3’RACE得到的GLS转录本由长到短分为7个亚型即3’UTR-1～7,不同细胞中3’UTR种类与比例不同,GES以3’UTR-1为主,MGC-803和BGC-803以3’UTR-5为主,AGS以UTR-6为主。4.生物信息分析显示与GLS 3’UTR可结合mi RNA可分两类,一类具有高度的专一性,只能与某种3’UTR亚型结合,如mi RNA-302仅与3’UTR-1结合,另一类可以和多类亚型结合,如mi RNA-23可以与3’UTR-1～7。当转染mi RNA-23后,相较于对照组与mimic NC细胞,胃黏膜细胞GES,胃癌细胞BGC-803与AGS细胞内GLS的相对表达量均下调;而当转染mi RNA-302后,只有胃黏膜细胞GES中GLS的相对表达量下调,而胃癌细胞BGC-803与AGS细胞内GLS的相对表达量变化不大。提示胃癌细胞的最长的GLS转录本所占比率极低。5.双荧光素酶报告基因结果表明GLS 3’UTR-1组细胞荧光强度和Gluc相对酶活显著低于NC组（P＜0.001）;GLS转录本GLS 3’UTR-2、GLS 3’UTR-3、GLS 3’UTR-4、GLS 3’UTR-5、GLS 3’UTR-6、GLS 3’UTR-7组细胞荧光强度和Gluc相对酶活显著高于GLS 3’UTR-1组（P＜0.01）。结论1.胃癌组织及正常胃黏膜均转录有GLS,胃癌组织的转录水平高于正常胃黏膜,胃癌细胞系的GLS转录与翻译水平高于正常胃黏膜上皮细胞GES。2.胃癌细胞与正常胃黏膜上皮细胞的GLS 3’UTR由长到短分为7个亚型,胃癌细胞以短亚型为主。胃癌细胞的3’UTR的转录本变短增强mi RNA调控反应。
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