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蛋传病是病原通过染病或带菌母鸡传给子代所引起的疾病。由于种鸡蛋传性疾病的蔓延,种鸡养殖企业普遍采用定期投喂有效抗菌药物的方法控制疾病的发生,但滥用药物,致使耐药菌株迅速增加。于是,人们把目光投放到抗菌多肽方面,这是由于抗菌多肽有着与青霉素等传统抗生素完全不同的作用机制,病原菌不易产生对这一大类抗微生物多肽的耐药性。
本研究主要探讨在鸡体内输卵管部位定位表达抗菌多肽--蜂毒肽和鸡防御素9,使得抗菌多肽在鸡蛋形成过程中便开始抑制病原体的入侵,并一起组装入鸡蛋,使之存在于蛋清中,以期提高雏鸡的出生率及降低病菌在传代过程中的感染率。
本研究克隆了鸡卵清蛋白(Ovalbumin,ov)5’端调控序列1.1kb,将之取代载体pVAX1上的CMV启动子,并将蜂毒肽与鸡防御素9基因分别插入其下游,构建了输卵管定位表达抗菌多肽系统pOV1.1-MLT和pOV1.1-AvBD9。未替换启动子的载体也插入抗菌多肽基因,构建重组真核表达载体pVAXI-MLT和pVAXl-AvBD9。
将上述构建的多个重组载体分别转染CHO细胞和Vero细胞,经体外培养后,通过RT-PCR和免疫荧光检测,重组蛋白MLT和AvBD9在CHO细胞中均获得表达,在Vero细胞中只有非定位表达载体获得表达,所得蛋白大小分别为MLT 5.36kD和AvBD9 5.24kD。将含表达产物的细胞浓缩上清液进行体外抑菌试验,结果表明MLT对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌都有较高的抑制效果,AvBD9对金黄色葡萄球菌抑制较强,对大肠杆菌和鸡白痢沙门氏菌的抑制较弱。由ov序列驱动的表达比CMV驱动的表达水平略低。
为了能真实反映在鸡体内外源基因的表达以及被调控的状况,本研究采用脂质体包裹,经静脉注射的方法将重组质粒导入鸡体内,使定位表达载体经血液到达输卵管组织,被输卵管细胞吸收后表达。在注射4天后宰杀鸡,取各内脏器官进行冰冻切片,并提取总RNA,经冰冻切片免疫荧光检测和RT-PCR检测,证明ov序列驱动的重组载体能在输卵管上皮细胞中表达,而在其他非输卵管组织,如肝、肾、肌肉、卵巢中都有表达,但与CMV驱动的表达量相比略低。
鸡卵清蛋白调控序列受固醇类激素的调节,因此在离体细胞中表达时,需要加入多种类固醇激素(如加入雌二醇、皮质酮和胰岛素),以提高表达水平。而在体内表(达,胸肌注射一定量的雌激素,也有利于定位表达重组质粒的表达。
综上研究,鸡卵清蛋白调控的输卵管定位表达系统的建立,为深入研究防治蛋传性疾病,以及利用抗菌多肽开发新型DNA药物都有着重要的理论意义与实际应用价值。