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本研究以鲁引1号、夏波蒂、早大白、大西洋4个品种的微型薯为材料,建立了离体再生体系和转基因技术体系,并用PVS-CP基因转化马铃薯4个品种,获得了转基因植株。
用脱毒微型薯获得的试管苗在2MS液体培养基上经20天培养即可获得健壮的植株。选取健壮的试管苗在MS+8%蔗糖与MS大量元素+微量元素+肌醇+3mg/L6-BA的2种培养基上,经暗培养可以结出试管薯,为通过试管薯途径保存与交流转基因材料提供了方便。
实验表明,鲁引1号、夏波蒂叶盘外植体在MS+0.5mg/LNAA+4mg/L6-BA培养基上可诱导出鲜绿色颗粒状、结构紧密的愈伤,愈伤在MS+5mg/L6-BA+1mg/LZT培养基上可分化出不定芽,分化率分别为86.7%和93.3%。个品种的微型薯切块在MS+2mg/LIAA+1mg/L6-BA+4mg/LZT+6mg/LKT的培养基上都可直接诱导出不定芽,鲁引1号的诱导率为63.3%,其他3个品种的诱导率均在90.0%以上。在MS培养基上可顺利生根,形成完整的植株。
用PVS-CP基因的上、下游引物及质粒pGEM-pvs为模板进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物为约900bp的特异条带。用Ultrafree-DA试剂盒一步离心法回收特异扩增条带并与pGEM-TEasy载体连接,连接产物转化受体菌DH5α获得氨苄青霉素抗性菌落,经PCR及单、双酶切鉴定,筛选出了阳性克隆,其重组质粒命名为pGEM-pvsk。
pGEM-pvsk经KpnⅠ与BglⅡ双酶切后回收目的基因片段,植物表达载体pCambia-2300-35S-OCS经KpnⅠ与BamHⅠ双酶切后回收9Kb的片段。2个回收后的DNA片段连接后转化受体菌DH5α,经卡那霉素抗性筛选、质粒电泳检测、PCR扩增及XbaⅠ的单酶切鉴定,筛选出了阳性克隆,其重组质粒命名为pCambia2300-pvsk。结果表明PVS-CP基因已定向插入到植物表达载体上,即获得了预期的PVS-CP基因的植物表达载体。该表达载体中PVS-CP基因受CaMV35S启动子的驱动,基因的3,末端是OCS终止子,在该质粒的T-DNA区除了PVS-CP基因外,还有NPTⅡ基因。
pCambia2300-pvsk转化农杆菌EHA105,经卡那霉素与利福平抗性筛选、PCR扩增及XbaⅠ单酶切鉴定,获得了预期的转化子EHA105(pCambia2300-pvsk)。
用农杆菌EHA105(pCambia2300-pvsk)侵染马铃薯的叶盘和薯块外植体,经卡那霉素抗性筛选获得了抗性不定芽及植株。4个品种的抗性植株经PCR检测都扩增出了900bp的目的基因片段,即获得了4个品种的转基因植株。