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肝脏是人体内重要的代谢器官,也是一个独特的免疫器官。肝脏长期受到来自胃肠道食物抗原和多种细菌成分的刺激,倾向于诱导免疫耐受,以维持内稳态。这种免疫耐受主要由肝内实质细胞和非实质细胞通过多种分子机制共同介导。寄生虫、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等嗜肝病原可能利用了肝脏这一特殊的免疫微环境形成慢性感染。肝脏慢性感染常常造成抗原特异性CD8~+T细胞数量低下、功能耗竭。有研究表明,病原相关分子模式(PAMPs)能刺激和调节肝血窦内皮细胞(LSECs)、Kupffer细胞(KCs),增强肝内CD8~+T细胞应答从而帮助控制感染。鞭毛素蛋白是一种细菌来源PAMPs,能够识别并激活细胞表面的Toll-like receptor 5(TLR5)和细胞内的NLRC4炎症小体两条信号通路。我们推测鞭毛素蛋白可能作用于表达TLR5或炎症小体受体的肝内细胞,从而调节肝内免疫应答。本论文利用重组鼠伤寒沙门氏菌鞭毛素蛋白(Salmonella-derived recombinant flagellin,SF)测定了鞭毛素蛋白对肝细胞、LSECs或KCs等肝内多种细胞的影响,分析了鞭毛素蛋白对肝内CD8~+T细胞的调节作用及其相关机制,并初步探究了鞭毛素蛋白在慢性HBV复制模型中潜在的抗病毒效应。一,肝内细胞与淋巴细胞体外共培养实验,测定SF对各种肝内细胞和CD8~+T细胞的调节。我们发现SF能够以剂量依赖方式调节肝细胞,减弱肝细胞对T细胞功能的抑制,而不能通过调节LSECs和KCs发挥类似作用。这种调节作用依赖于肝细胞TLR5信号通路而不是NLRC4炎症通路的激活。TLR5通路激活的肝细胞能够促进CD8~+T细胞CD25、CD44、CD69的表达和T-bet、Eomes转录因子的表达以及功能性细胞因子IFN-γ、TNF-α的分泌。进一步实验发现TLR5激活的肝细胞可直接调节多克隆CD8~+T细胞的活化和细胞因子分泌,而不依赖于抗原提呈细胞(APCs)或CD4~+T细胞的辅助,且对抗原特异性CD8~+T细胞具有相同调节作用。总之,SF可激活肝细胞的TLR5信号通路,影响其免疫调节能力,进而促进CD8~+T细胞的活化和功能。二,SF对小鼠肝内细胞的激活,对CD8~+T细胞的调节,及其对急性HBV复制的影响。多次腹腔注射SF能够减弱肝细胞对T细胞功能的抑制效应,提高肝内CD8~+T细胞的能量代谢相关蛋白表达,但对急性HBV复制和特异性T细胞应答没有明显影响。高压水动力(Hydrodynamic injection,HDI)尾静脉注射一次SF后第5-7天可测到小鼠肝内CD8~+T细胞的活化改变和功能增强,且其功能增强与SF诱导的肝细胞免疫调节功能改变相关。此外,HDI注射SF能够一定程度抑制急性HBV复制,增强肝内病毒特异性CD8~+T细胞应答。综上:SF体内注射可调节肝细胞免疫状态和肝内CD8~+T细胞的活化与功能,并提高肝内病毒特异性CD8~+T细胞的应答。三,利用慢性HBV复制小鼠模型评估SF在慢性HBV治疗方面的潜在作用。HDI注射SF仅短暂抑制HBV DNA,对病毒复制整体进程没有影响。进一步在慢性HBV复制小鼠过继CD8~+T细胞发现:多次腹腔预注射SF能够抑制病毒复制并加快病毒清除;HDI预注射SF也能够抑制病毒复制并增加肝内抗原特异性CD8~+T细胞的比例,但未能观察到对病毒清除速率的影响。上述结果提示:SF可通过调节肝内免疫微环境增强肝内抗原特异性CD8~+T细胞的抗病毒功能,有利于慢性病毒感染的免疫控制。而给药方式、剂量及与免疫应答的配合有待进一步研究优化。综上所述,本论文通过体内外实验证明了鞭毛素蛋白能够调节肝细胞的免疫状态,进而调节肝内CD8~+T细胞的应答,并且增强CD8~+T细胞在慢性HBV治疗的效果。本研究初步阐明了鞭毛素蛋白调节肝内CD8~+T细胞的效应及其细胞和分子机制,对于治疗慢性HBV感染具有一定的潜在应用价值。