大花红景天酪氧酸脱羧酶基因的克隆与功能分析

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红景天苷是从红景天(Rhodiola rosea L.)中提取的一种糖苷(又称配糖体或甙),是由尿苷二磷酸葡萄糖的半缩醛羟基与另一非糖物质酪醇中的羟基以缩醛键(甙键)脱水缩合而成的环状缩醛衍生物。水解后能生成糖与非糖化合物,非糖部分称为甙元(Aglycone),酪醇属于酚类化合物。红景天苷具有抗衰老、增强免疫力、保护心血管、抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤等作用。但天然药源植物红景天中红景天苷含量较低(0.5%~4.1%,DW),大大限制了商业化的生产,红景天苷的产量远远不能满足市场的需求。化学合成红景天苷成本高、回收率低,且国内外报道的化学合成红景天苷的方法相对来说没有从天然红景天植物中提取的多。近年来,随着红景天生物合成途径相关酶基因的克隆,基因工程方法成为提高红景天苷含量的有效途径之一。本研究在前人研究的基础上,采用RACE技术,以西藏大花红景天为研究材料,克隆获得了红景天苷生物合成途径中的关键酶酪氨酸脱羧酶基因(TYDC),并对其做了相应的生物信息学分析和功能验证。   TYDC催化酪氨酸转化生成酪胺(对羟基苯乙胺),是红景天苷生物合成途径中必需的一个酶。本研究基于RACE技术的同源性克隆方法,获得了RcTYDC基因全长cDNA,为1657bp,RcTYDC编码区长为1473 bp,编码长490个氨基酸的蛋白质,还包含一段长为79 bp的5’-UTR和105bp的3’-UTR,polyA长度为13bp,预测分子量大小为54.6kDa,预测等电点为5.55。   对RcIYDC编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明RcTYDC与来源于其他植物的TYDC同源性高达45%~51%,且具有典型的TYDC催化活性域。在分子发育进化树上,RcTYDC与来源于植物、藻类、细菌、古细菌的TYDCs在发育进化树上聚为4支,RcTYDC与来源于植物玉米、水稻的TYDC亲缘关系较接近,同属于植物这一分支。跨膜区分析表明,RcTYDC整个氨基酸序列均不存在跨膜区,说明其是一个胞质蛋白。对RcTYDC的三级结构模型预测表明,RcTYDC与来源于野猪的TYDC的晶体模型具有高度的相似性,且具有典型的TYDC催化活性位点。对RcTYDC基因进行功能验证,结果表明将携带RcTYDC编码区的质粒pET28-RcTYDC转入大肠杆菌Rosetta进行原核表达之后,能使Rosetta菌株合成大小约53 kDa的重组RcTYDC蛋白。利用尿素对该蛋白进行提取并透析复性后,以L-酪氨酸为反应底物,在辅酶磷酸吡哆醛的存在下,检测RcTYDC重组蛋白的催化活性,并用HPLC检测到反应产物酪胺的生成表明本研究中克隆获得的重组的RcTYDC蛋白具有TYDC酶的活性和功能。   本研究还成功建立了大花红景天的无菌苗培养体系,构建了RcTYDC基因的植物高效表达载体。本研究的相关工作为红景天苷生物合成的代谢调控奠定了基础,为今后在中草药中开展代谢途径工程提供了启发意义和借鉴价值。随着红景天苷生物合成相关酶基因的陆续被克隆,以及红景天苷生物合成途径的进一步认识,利用代谢工程手段提高红景天苷含量越来越成为可能实施的一种重要手段。
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