调节小RNA(small regulatory RNAs,s RNAs)简称小RNA,长度在50-500nt之间,常见于原核和真核生物当中,主要介导基因转录后调控。小RNA在微生物中主要通过影响靶标基因m RNA的稳定性或者蛋白质的活性来完成对靶基因的调控。根据小RNA在基因组的位置以及与靶标基因结合的方式,小RNA的分类可以分为顺式编码小RNA和反式编码小RNA。顺式编码小RNA主要通过严格性碱基互补配对结合靶标m RNA从而促进或者抑制基因的转录,反式编码小RNA主要通过不完全性结合靶标m RNA来促进或者抑制基因的转录。反式编码小RNA在大多数情况下会结合伴侣蛋白Hfq,以增加小RNA与靶标m RNA结合的稳定性,Hfq在原核生物中比较常见,它是一种同源的六聚体蛋白质,并且在复杂的基因转录调控网络中占据了重要的地位。Hfq一般会与细菌小RNA中“AU”富含区结合,Hfq参与的小RNA与靶标m RNA的结合发生在5’端的核糖体结合位点附近以及翻译起始位点,从而抑制m RNA的翻译或者直接导致m RNA的降解[1-3]。小RNA在细菌的致病过程中有着重要的调控作用,主要通过调控毒力基因的表达从而影响细菌的侵袭力,致病力以及对抗宿主免疫的能力。细菌外膜蛋白和LPS是构成细菌细胞壁的主要成分,外膜蛋白表面携带具有免疫原性的抗原,能够介导细菌与宿主之间的相互作用,小RNA通过影响细菌外膜蛋白的合成以及修饰细菌细胞壁LPS从而影响细菌对宿主细胞的粘附力和侵袭力。除此之外,小RNA能够影响细菌生物膜的形成以及通过分泌自诱导分子(AI)调控细菌的群体感应能力。细菌在适应多变的外界环境时,形成了复杂而有效的调控网络,而小RNA是致病菌调控网络中重要的组成部分。鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis,以下简称鼠疫菌)能够引发高死亡率的疾病,鼠疫。它是一种疫源性的细菌,通常只会在动物之间进行传播,引起动物之间的鼠疫。人类一般是通过被感染的跳蚤叮咬从而间接性感染鼠疫,临床特征较为明显,主要引起淋巴结的肿胀,疼痛以及能够迅速引起严重的毒血症和败血症,致死率较高。瘟疫在历史上发生过三次大流行,是我国的法定甲类传染病。鼠疫菌是一种较“年轻”的病原体,在大约5021-7022年前由假结核耶尔森氏菌进化而来的,是重要的生物战剂。鼠疫菌胞质中有很多质粒,p CD1,p MT1和p PCP1是与鼠疫菌的毒力息息相关的三个质粒,其中p MT1和p PCP1是鼠疫菌进化过程中获得的质粒,对鼠疫菌的毒力和应对环境的变化有重要的作用。本课题选取的研究对象是小RNA Hms A,位于鼠疫菌p PCP1质粒上,因此,小RNA Hms A可能对鼠疫菌的毒力具有一定的调控作用,本课题的主要研究内容是研究小RNA Hms A对鼠疫菌毒力的调控作用及具体的分子调控机制。根据本实验室早期的研究结果发现了小RNA Hms A位于p PCP1质粒上9435-9500位碱基上,并确定了Hms A的转录起始位点。为了研究小RNA Hms A对鼠疫菌毒力的调控,我们设计了鼠疫菌野生株与小RNA Hms A突变株在小鼠体内的竞争指数的测定实验。实验结果表明,在小鼠的肝脏和脾脏内对鼠疫菌突变株与野生株的携带量不同,小RNA Hms A突变株相比野生株明显降低,表明了小RNA Hms A对鼠疫菌毒力具有抑制的作用。同时,我们通过高通量测序比较了鼠疫菌野生株(WT)和小RNA Hms A的突变株(?hms A)差异性的表达基因。实验结果表明,具有差异性表达的基因共有413个,上调的基因有105个,下调的基因有308个,通过对差异性表达的基因主要功能的分类,我们查找了与鼠疫菌毒力相关的基因(psa EF以及hms T,hms S),并已有结果证实了Hms A对这些基因具有一定的调控作用,但是小RNA Hms A直接作用的毒力靶标基因还未确定,为了进一步寻找,我们构建了小RNA Hms A过表达菌株,并通过RNA-seq高通量测序的方法分析了小RNA Hms A过表达菌株阿拉伯糖诱导前后全基因组差异性基因的比较,筛选出了25个候选靶标基因,通过q RT-PCR检测了小RNA Hms A对靶标基因转录水平的调控作用,进一步筛选出了3个靶标基因,它们分别是YPO3620,YPO3622以及YPO3905。初步完成了对小RNA Hms A全基因组筛选的靶标基因。最后通过β-半乳糖苷酶报告基因融合实验构建的翻译融合载体,对小RNA Hms A候选靶标基因逐个进行验证,实验结果显示小RNA Hms A对YPO3620,YPO3622以及YPO3905基因的转录水平都有调控作用,但转录后水平没有调控作用,因此,小RNA Hms A直接作用的毒力靶标基因还需要进一步确定。