拟穴青蟹过氧化物还原酶基因克隆、表达分析及其生物学功能研究

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拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海重要的海水养殖蟹类之一,然而外界病原感染和生存环境恶化,给青蟹养殖业带来了严重影响。过氧化物还原酶(Peroxiredoxin,Prx)是一类抗氧化蛋白家族,可以清除机体在环境胁迫下产生的过量活性氧(Reactive oxygen species,ROS),维持体内氧化还原平衡,是抵抗外界不良环境影响的重要因子。本研究首先采用同源克隆策略和RACE技术从拟穴青蟹中克隆得到6个Prx基因(SpPrx1/2、pPrx3、pPrx4、SpPrx5-1、SpPrx5-2、SpPrx6)的cDNA序列,分析了基因序列及其编码氨基酸序列,并将其与脊椎及无脊椎动物Prx基因家族进行比较分析;其次采用实时荧光定量PCR技术检测拟穴青蟹Prx基因在不同组织中表达情况,并分别检测溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、poly(I∶C)生物胁迫,以及盐度、重金属镉(Cd)非生物胁迫下拟穴青蟹Prx基因在肝胰腺中的时序表达规律;最后将SpPrx1/2、SpPrx4、SpPrx5-1、SpPrx6基因体外重组表达与纯化,并进行过氧化氢清除等功能方面试验。  试验结果表明,拟穴青蟹SpPrx1/2、SpPrx3、SpPrx4、SpPrx5-1、SpPrx5-2、SpPrx6基因开放阅读框分别为597、690、738、561、429、660bp,对应编码蛋白长度为198、229、245、186、142、219个氨基酸。6个拟穴青蟹Prx基因编码蛋白均含有保守Cys,根据保守Cys数目及保守性高低,可分别归入三个亚家族:典型2-Cys Prx(SpPrx1/2、SpPrx3、SpPrx4)、非典型2-Cys Prx(SpPrx5-1、SpPrx5-2)、1-Cys Prx亚家族(SpPrx6)。其中,SpPrx1/2经比对分析,因不能归入已知Prx1或Prx2亚型,暂命名为Prx1/2。此外,本研究在拟穴青蟹中发现两个Prx5基因,这是迄今为止在一个物种中存在两个Prx5基因的首次发现。  荧光定量试验结果表明,拟穴青蟹6个Prx基因在所检测的心脏、肝胰腺、鳃、肌肉、肠和血细胞等6个组织中均有表达,但表达量有所区别。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、poly(I∶C)生物胁迫,以及盐度、重金属镉(Cd)非生物胁迫下,拟穴青蟹6个Prx基因表达水平有显著变化,而表达模式不同,说明青蟹Prx基因有助于机体抵抗生物或非生物胁迫,且不同Prx基因在青蟹体内生物功能有所差别。体外H2O2清除试验表明,在二硫苏糖醇(DTT)存在时,重组SpPrx1/2、SpPrx4、SpPrx5-1、SpPrx6蛋白均具有过氧化物酶活性等生物学功能。  本研究首次从拟穴青蟹中克隆得到6个Prx基因,这也是首次对甲壳动物Prx基因家族进行系统阐释。同时,本研究中生物和非生物胁迫下拟穴青蟹Prx基因表达情况,为进一步深入研究Prx基因家族以及拟穴青蟹抗逆性研究方面积累基础材料。
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