研究背景与现状遗传性血友病A(HA)是一种伴X染色体隐性遗传的出血性疾病,主因基因缺陷致先天性凝血因子Ⅷ缺失引起凝血功能障碍。遗传性血友病A的主要临床表现是外伤后或自发性的反复出血,严重出血可致死,而长期反复出血可致残。目前,FⅧ替代是该病唯一有效治疗手段。但外源性的FⅧ可刺激机体产生同种抗体,即FⅧ抑制物。抑制物可通过水解及占位效应阻碍Ⅷ执行凝血功能,使替代治疗无效。这已成为遗传性血友病A治疗面临的世界性瓶颈问题。遗传性血友病A的发病率为5-10/10万,分布无地区及种族差异。中国占世界人口总数1/5,推测我国遗传性血友病A病例约10-13万。世界血友病联盟组织(WFH)2011年调查显示,全世界108个国家登记的血友病A病例达134,154例,该调查覆盖了90.6%的世界人口。而同期我国登记的遗传性血友病A仅8921例,仅为估计数的1/10,多数病例尚未被检测登记。但WFH报告显示中国上报血友病登记病例数(HA及其他)正在逐渐增加：2006、2008及2010年分别为5044、5126及8590例。其中,2010年仅登记的HA就达7365例。国外研究发现,抑制物在重型血友病A患者中的发生率可达20-30%。2007-2008年中国诺和诺德血友病基金进行了一项多中心的血友病A抑制物筛查,结果显示我国FⅧ抑制物检出率为3.9%(56/1435),其中重型占4.3%(48/1108)。而2011年我们课题组报道的单中心血友病A抑制物累积发生率为11.6%(25/215)[6]。说明我国FⅧ抑制物检出率随着筛查频度和治疗剂量的增加而增加中。随国家对血友病工作的逐渐重视,我国血友病A患者的诊疗状况正呈现新的特点[7],我们也不得不面对随之而来的新问题,即我国血友病A患者的抑制物检出率将大大增加。有证据显示,血友病A抑制物为宿主因素与治疗因素共同作用形成。其中,较明确的宿主因素如：1.Ⅷ基因突变类型[8]；2.免疫调节分子基因；3.抑制物阳性家族史、种族与人种等。而治疗相关因素有：1.首次治疗年龄；2.暴露日(ED)在未经治疗的血友病A患者人群(PUP)中,约95%抑制物在前50ED内出现,而前20ED内出现者达50%；3.暴露方式按需治疗的抑制物发生率较高,早期规律预防治疗不仅能预防出血,而且可明显降低血友病A患者抑制物发生率达60%,其已成为欧美等西方国家血友病A患者的主要治疗方式；4.其他如注射方式及免疫系统的激发等。此外,产品种类与抑制物产生间的关系,目前仍存在争议。我们与国内其他前期研究结果证实我国遗传性血友病A患者抑制物发生的宿主方面危险因素与国外研究结果类似。但对发展中国家而言,包括中国,因为FⅧ制品短缺与经济原因,在治疗相关因素方面与欧美国家差异明显。我们课题组一项前期调查显示,华南地区血友病A患者凝血因子使用量仅227-278IU/Kg/年,远低于国外控制出血保护关节的标准(1900-8200IU/Kg/年)；同期国内北方的两大血友病登记中心的调查也得到近似结果[22,23]。为尽早预测抑制物发生风险,CANAL研究组近年建立了临床预测FⅧ抑制物发生的评价方法。其评价指标包括：抑制物的家族史、FⅧ基因突变类型、治疗初始的强化治疗、首次暴露的年龄及首次暴露的原因。通过分析,包括阳性家族史、高危FⅧ基因突变以及起始强化治疗的三项指标最终确定。该方法已经在注册PUP研究数据库中进行了验证。对于中国血友病患者而言,CANAL建立的临床预测FⅧ抑制物发生的评价方法是否适用尚有待验证。研究目的与意义FⅧ抑制物使遗传性血友病A患者出血增多,增加其致残甚至致死风险,严重降低患者生活质量,为其家庭及社会带来沉重负担。但由于各种条件限制,我们尚没有中国FⅧ抑制物患者的疾病负担数据,尚无法直接借鉴欧美等西方国家的有关研究成果。借鉴国内文献资料和我们的前期工作,我们发现国内血友病A患者发生的抑制物以低滴度为主,与国外相异。而我们课题组前期回顾性分析发现,不同抑制物背景下血友病A患者的临床表现不同。为此,我们拟经过初步分析中国FⅧ抑制物患者的基本临床特征与疾病负担,客观评价这一群体患者的生存状况。目前国内Ⅷ抑制物防治研究尚在初期探索阶段。国内尚未有抑制物发生风险预测的研究,因此,我们假设FⅧ基因突变类型为主要评价指标的CANAL评价方法同样适用于中国患者,通过我们的随访数据验证CANAL建立的临床预测FⅧ抑制物发生的评价方法的可行性,以期建立针对中国患者特点的早期筛选抑制物产生风险的不同患者群体的方法,有助于我们早期确定高危的患者人群,并为制定合理的个体化替代方案提供指导,在有限资源条件下降低我国血友病A患者的疾病负担。研究方法不同抑制物背景血友病A患者临床表现分析1.收集广东省血友病病例信息管理中心(南方医院血友病登记中心)2007年6月-2013年3月登记的所有FⅧ抑制物阳性血友病A患者共40例,作为抑制物阳性组；另按年龄、体重、疾病严重度及暴露日配伍筛选40例抑制物阴性血友病A患者为抑制物阴性组,作为配对比较研究对照。抑制物阳性组中参照WFH标准,根据抑制物滴度水平进一步划分研究亚组进行比较研究,抑制物滴度峰值≥5BU为高滴度反应性(HR)组,<5BU为低滴度反应性(LR)组。2.采用一期法检测FⅧ活性,Bethesda法筛查FⅧ抑制物滴度水平。3.统计初次抑制物阳性后6个月内出血事件,对照组统计同期出血事件；重复出血不计算为新发出血事件。再次新出血、出血程度评价及靶关节等定义均参照WFH2012年标准。4.计量资料采用T检验,计数资料采用Pearson卡方检验,等级资料采用非参数方法检验,应用SPSS13.0软件进行统计分析。不同抑制物背景血友病A患者FⅧ基因突变分析1.所有80例血友病A患者进行FⅧ基因突变类型检测：采用LD-PCR法检测内含子22倒位、双管法检测1倒位、基因组DNA测序采用双脱氧核酸终止法。2.采用Pearson x2检验比较不同Ⅷ抑制物背景血友病A研究对象中基因突变类型分布,采用SPSS13.0软件进行统计分析。3.参照CANAL研究建立logistic抑制物风险预测模型。研究结果1.研究对象临床分型所有80例研究对象均男性,中位年龄21(1-62)岁,中位随访51(3-69)月。其中,轻型(Ⅷ：C>5%)4例(5%)、中型(Ⅷ：C1-5%)16例(20%)、重型(Ⅷ-C<1%)60例(75%)。血友病家族史阳性患者59例(73.8%),所有患者均无肯定抑制物阳性家族史。2.抑制物阳性患者特征40例抑制物阳性患者中21例(52.5%)为LR组,19例(47.5%)为HR组；LR组抑制物初始滴度、峰滴度及中位滴度均低于HR组(P=0.000)；LR及HR组患者中位初次暴露年龄分别为13岁及15岁(P=0.202)；中位首次发现抑制物时年龄分别为16VS18岁(P=0.616)；中位首次发现抑制物时FⅧ暴露日(ED)有统计学差异(150VS100天,P=0.026)。3.不同抑制物背景患者临床表现比较阳性组患者出血情况明显重于阴性组患者,出血频次多大于5次／月(52.5%VS17.5%,P=0.007)；且重度出血为主(45.3%VS39%,P=0.000)。但两组间靶关节数目差异无统计学意义(P=0.615)。研究期内,观察到阳性组中16例患者抑制物自然阴转。自身对比其不同抑制物状态下出血情况发现,抑制物阳性时可能较其抑制物阴转时出血更频繁,出血频率≥5次／月43.75%vs25%(P=0.081)；且抑制物阳性时出血程度明显严重(39.5%vs35.7%,P=0.034)。HR组患者出血较LR组更频繁,68.4%(13/19)平均每月出血大于5次(P=0.047)；且所有可统计出血事件中,前者近半(52.4%)为重度出血(P=0.02)；但两组靶关节受累情况无差异(P=0.178)。4疾病负担比较(1)治疗方式86.8%(33/38)的抑制物阴性组患者主要通过购药后自己或家人帮助下自我注射替代治疗,而半数(53.8%,21/39)抑制物阳性组患者则需于诊所或医院接受凝血因子静滴(P=0.000)；相对LR组,HR组患者则更多(84.2%,16/19)的需于医疗机构接受治疗(P=0.001)。区别形成的主要原因考虑为：通过血友病中心培训,多数患者或其家属已掌握自我注射方法,而抑制物阳性者中除部分LR组患者可以使用加量FⅧ治疗仍可自我注射之外,半数以上患者尤其HR患者无法再采用FⅧ治疗,需替换为PCC滴注或重组FⅦa,难于在家庭完成治疗。(2)治疗费用抑制物阳性与阴性组患者用于购买凝血因子(血浆源／重组FⅧ、PCC及重组FⅦa)的平均花费无明显统计学差异(P=0.169)；但阳性组患者需更多的抑制物监测等检测费用(P=0.028)。87.5%(18/37)的HR组患者(未包括1例ITI治疗HR患者)平均每年花费￥3.3万元以上用于购买PCC及重组FⅦa以控制出血,高于LR组患者(P=0.001)；而且HR组患者若实施ITI治疗,则其治疗费用更加巨大。研究期内,一例HR患者6月内即花费￥160万用于购买FⅧ制品以用于诱导免疫耐受治疗。但HR与LR组患者的辅助检查花费比较无统计学差异(P=0.086)。(3)抑制物转归①持续阳性：随访期内,阳性组23例(56%)患者持续抑制物阳性。其中,LR组中6例患者滴度无明显变化。HR组中13例患者抑制物滴度均有不同程度下降,但仍>5BU；4例患者抑制物滴度反复降低后升高,考虑与重度出血后自行使用FⅧ有关。②自然阴转：随访期内,LR患者抑制物自然阴转率高于HR组(66.7%VS10.5%),且中位抑制物阴转时间较短(11月VS55月),观察期内未见阴转后再次出现抑制阳性病例。③诱导免疫耐受治疗(ITI)：随访期内仅1例高滴度反应性抑制物阳性患者行ITI治疗部分有效,转为低滴度反应性抑制物组。5.FⅧ基因突变分析：(1)基因突变类型分布87.5%(70/80)患者检出FⅧ基因突变类型；10例患者基因突变类型未检测出,其中抑制物阳性组4例,阴性组6例,可能与患者所携带基因为不常见类型突变有关。所检出的高危FⅧ基因突变类型：所有患者中大片段缺失4.28%(3/70),无义突变1.42%(1/70),均为抑制物阳性患者；内含子22倒位占47.1%(33/70),内含子1倒位10%(7/70)；低危突变FⅧ基因类型：点突变7.1%(5/70),小片段缺失21.5%(15/70)、插入突变8.6%(6/70)。(2)基因突变类型比较FⅧ基因突变比较：①相对于阴性组,抑制物阳性患者多携带高危突变FⅧ基因型(69.4%VS55.9%,P=0.031)；②抑制物阳性亚组比较中,HR组患者携带的突变FⅧ基因多以高危突变基因为主,与LR组存在差异(88.2%VS52.6%,P=0.02)。(3)抑制物风险评估检测统计所有研究对象临床资料及基因检测结果,参照CANAL抑制物风险预测方法[24](P=1/[1+e-(-2.332+1.131*FHI+1.089GMT+1.769*ITM5f)];ITM5f为集中治疗指标,表示首次使用FⅧ时连续治疗天数；FHI为抑制物家族史指标；GMT为FⅧ基因型指标)采用logistic回归建立抑制物预测模型。因本组研究对象均无明确抑制物阳性家族史,故选取ITM5f及GMT双变量建模,结果显示,回归模型有统计学意义(X2=6.703,P=0.035),说明模型可用。参照CANAL研究依据预测指标划分患者为高、中、低危抑制物风险患者群,其可能的抑制物发生风险分别为11%、53-55%及91%。比较发现,我们主要根据FⅧ基因突变类型的预测结果与CANAL研究(n=332)的预测趋势是一致的,说明CANAL研究开发的血友病A抑制物发生的临床预测评分方法同样基本适用于我国早期预测潜在高危抑制物的患者。研究结论1.不同抑制物背景血友病A患者的临床表现抑制物阳性组出血发生率及严重度均明显高于阴性组；HR组出血发生率及严重程度亦高于LR组,而且其抑制物难于自然清除。2.不同抑制物背景血友病A患者疾病负担比较由于国情条件,抑制物阳性患者因治疗方式改变及检测费用增加而加重其疾病负担,尤以HR组明显。3.不同抑制物背景血友病A患者FⅧ基因突变分析提示FⅧ基因突变类型与抑制物的产生有关,抑制物阳性患者较阴性者更多携带高危突变FⅧ基因型,而且HR组患者较LR组者更多携带高危突变FⅧ基因型。说明伴重大缺陷FⅧ基因突变者有较大可能产生抑制物尤其出现高滴度反应性抑制物；4. CANAL研究开发的血友病A抑制物发生的临床预测评分方法同样适用于我国早期预测潜在高危抑制物的患者。