目的:脑血管病是导致我国成人残疾和死亡的第一原因,其中以缺血性脑血管病最为常见。脑缺血后继发性脑损伤是病情加重及影响预后的重要原因,氧化应激、炎症反应、细胞凋亡及线粒体功能异常、钙超载、兴奋氨基酸毒性、自噬等因素均有参与。缺血性脑血管病机制复杂不明,目前缺乏有效治疗手段,是亟待解决的医学问题。急性局灶脑缺血中,氧化应激可介导梗死区域继发性神经元死亡。自噬在缺血再灌注情况下是一把双刃剑,细胞可启动适度的自噬来清除受损细胞器及异常折叠蛋白质,对细胞起到重要的保护作用,但不完全或过度自噬现象可能导致细胞死亡。近来越来越多的实验证据表明,氧化应激能诱导自噬的发生,并且,应用抗氧化剂能抑制自噬并减少细胞死亡。丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)是一种提取自丹参的水溶性单体成分,具有强大的抗氧化作用及其他多种生物学活性。Sal B可以通过抑制凋亡的机制保护缺血心肌细胞,也有文献报道Sal B可通过抑制自噬来保护饥饿状态的心肌细胞。本实验旨在研究Sal B这一氧自由基清除剂对急性期局灶性脑缺血小鼠是否存在脑保护作用,且其作用机制是否为抑制凋亡及自噬水平。方法:采用雄性CD1小鼠(体重25-30g),应用改良Longa法建立小鼠右侧p MCAO模型。实验分为三部分:实验一:探究Sal B对急性期局灶性脑缺血小鼠的脑保护作用小鼠随机分为4组:Sham组(Sham+生理盐水)、p MCAO组(p MCAO+生理盐水)、丹酚酸B低剂量组(p MCAO+Sal B 10mg/kg,Sal-L)、丹酚酸B高剂量组(p MCAO+Sal B 25mg/kg,Sal-H)。各组小鼠按照统一标准进行麻醉与造模,造模成功后,药物干预组即刻腹腔注射Sal B,Sham组和p MCAO组用则给予等量生理盐水。术后24 h采用Longa法及Clark法对小鼠进行神经功能缺损评分。评分完毕后将动物断头处死,用干湿重法测定脑组织含水量,用TTC染色法测定脑梗死体积,用伊文斯兰染色法测定血脑屏障通透性,用western blot测定紧密连接蛋白Claudin-5的含量,用尼氏染色法测定梗死交界区神经细胞损伤情况,用电镜观察超微结构改变(梗死皮层超微结构如自噬体的形成、细胞凋亡情况和微血管损伤情况等)。实验二:局灶性脑缺血小鼠各因子分区表达对Sham及p MCAO组小鼠于术后24h行免疫组织化学染色测定LC3、beclin1、p62、bcl2、bax、Caspase-3的阳性细胞分布情况及计数情况。行免疫荧光染色观察beclin1及Caspase-3是否存在共标。观察western blot测定PGC-1α及Sirt1的分区表达。实验三:Sal B脑保护作用机制的探究首先,根据因子分区表达情况选定测定的分区:LC3、beclin1、p62于梗死周边区观察;bcl2、bax、cleaved Caspase-3于梗死中心区观察。应用western blot及RT-q PCR进行测定Sham组、p MCAO组、Sal-L组、Sal-H组相应分区各因子的蛋白、m RNA含量的变化。对不同分区凋亡相关信号通路重要因子MAPKs及能量代谢通路重要因子PGC-1α及Sirt1行western blot及RT-q PCR测定其蛋白、m RNA含量的变化。用DHE染色测定梗死侧皮层ROS的生成量,分别应用MDA含量及SOD活力试剂盒测定梗死皮层脂质过氧化程度及机体清除氧自由基的能力。总之,分别从凋亡、自噬、氧化应激三方面探讨丹酚酸B脑保护作用机制。结果:1丹酚酸B对急性期局灶性脑缺血小鼠具有保护作用1.1丹酚酸B改善行为学评分p MCAO术后24 h,分别采用Longa法及Clark法对各组小鼠进行行为学评分,对此采用Mann-Whitney U检验统计并分析结果。采用Longa评分法及Clark评分法时,与p MCAO组相比,Sal-L组和Sal-H组的神经功能评分明显改善,且差异具有统计学意义(P<0.01)。1.2丹酚酸B降低脑梗死体积p MCAO术后24 h,Sal-L组和Sal-H组因药物干预梗死体积明显减小,且差异具统计学意义(Sal-L组和Sal-H组vs.p MCAO组:51.09%±12.65%和34.31%±7.93%vs.65.94%±2.96%,P<0.05)。1.3丹酚酸B保护血脑屏障1.3.1丹酚酸B减轻脑水肿:p MCAO术后24 h,Sal-L组和Sal-H组梗死侧脑组织含水量较p MCAO组明显减少(P<0.05)。1.3.2丹酚酸B降低血脑屏障通透性:局灶性脑缺血后24h,Sal-L组和Sal-H组右侧大脑半球脑组织伊文斯兰含量均明显低于p MCAO组(P<0.05)。1.3.3丹酚酸B上调Claudin5表达:局灶性脑缺血后24h p MCAO组右侧大脑半球Claudin5蛋白表达量降低,与Sham组比较有差异(P<0.05)。p MCAO组左侧半球与Sham组的Claudin5蛋白含量无统计学差异。应用Sal B干预后,Claudin5含量增加,紧密连接崩解减少,血脑屏障受到保护。1.3.4丹酚酸B保护血脑屏障超微结构取右侧大脑半球皮层行电镜检测,结果显示:除Sham组外均有不同程度内皮细胞受损,细胞核增大,紧密连接开放,基底膜模糊,可见红细胞阻塞微血管,管周有液体渗出,周围脑组织细胞水肿。p MCAO组最为严重,周围组织高度水肿;Sal-H组较p MCAO组管周液体渗出减少,紧密连接较完好且基底膜更为完整。1.4丹酚酸B减少神经细胞损伤1.4.1丹酚酸B增加尼氏染色中存活细胞数目,Sal-L组和Sal-H组较p MCAO组存活细胞数目增多(P<0.05)。1.4.2丹酚酸B改善组织超微结构,同时还可观察到局灶性脑缺血后的自噬现象,p MCAO组小鼠梗死灶周围皮层可见直径平均500nm的双层膜的自噬小体。2局灶性脑缺血后不同区域因子表达变化不同2.1 p MCAO及Sham术后24小时,Caspase-3、bax、bcl2的免疫组织化学结果显示Sham组bax及Caspase-3表达量很少,bcl2作为抗凋亡因子在正常组织中有一定程度的表达。梗死对侧皮层组各因子阳性细胞数计数与Sham组无明显差异;梗死中心皮层组Caspase-3及bax表达明显上升,阳性细胞数目显著增多(Core vs.Sham,P<0.05),bcl2表达明显下调,阳性细胞数目减少(Core vs.Sham,P<0.05);梗死周边皮层组Caspase-3及bax表达有所上调且有统计学意义(P<0.05)但幅度远小于梗死中心皮层,bcl2表达上调且阳性细胞数增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。pMCAO组中,梗死中心皮层组各自噬相关指标几乎未见阳性细胞,与Sham组有显著差别,梗死对侧皮层组自噬相关指标阳性细胞数目与Sham组相比无统计学差异。梗死周边皮层自噬水平显著提高,LC3、beclin1及p62表达均显著上升(P<0.05)。2.2免疫荧光显示beclin1+与Caspase-3+细胞有明显分界,未观察到存在了beclin1+/Caspase-3+细胞。2.3脑缺血组织分区:将脑皮层分为梗死对侧皮层(Contralateral),梗死周边皮层(Pericore)及梗死中心皮层(Core)。Core组PGC-1α及Sirt1蛋白表达水平较sham组明显下调,pericore组及contralateral组则较sham组上升。3丹酚酸B脑保护作用机制的探究3.1丹酚酸B的抗氧化作用:Sal B通过清除ROS、降低梗死半球脑组织MDA含量并恢复SOD活性来抗氧化。3.2丹酚酸B的抗凋亡作用:术后24小时,western blot结果显示Cleaved Caspase-3/GADPH及bax/bcl2比值较Sham组明显升高。Sal-L组和Sal-H组较p MCAO组的Cleaved Caspase-3/GADPH及bax/bcl2比值明显降低。RT-q PCR结果符合组织化学染色结果。用药后,Sal-L和Sal-H的Caspase-3及bax基因表达降低且有统计学差异。3.3丹酚酸B抑制自噬的作用自噬相关指标在蛋白表达层面包括LC3II/GADPH、beclin1/GADPH及p62/GADPH;其相对应基因表达层面包括MAP1LC3b/ACTB、BECN1/ACTB及SQSTM1/ACTB。低剂量的Sal B干预可明显降低各个指标的表达量,高剂量效果较之稍逊色。与western blotting结果一致,p MCAO组各指标m RNA的表达较Sham组明显增加。与p MCAO组相比,Sal-L组各指标的表达量明显减少,高剂量较之效果逊色,与Western blot结果一致。3.4丹酚酸B下调梗死中心皮层p-p38及p-erk1/2表达3.5丹酚酸B上调梗死周围皮层Sirt1-PGC-1α通路的蛋白及基因表达结论:Sal B对急性期局灶性脑缺血小鼠的具有脑保护作用,可以改善神经功能缺损评分(Longa法及Clark法),降低梗死体积,保护血脑屏障,增加增加尼氏染色中存活细胞数目以及改善组织超微结构。局灶性脑缺血中可观察到细胞自噬现象,可见典型自噬体形成及自噬溶酶体的形成,也可观察到典型的细胞凋亡。免疫组织化学检测自噬相关因子及凋亡相关因子的表达及分布,发现两者分布不同。自噬相关指标于梗死周边皮层表达上调(如LC3及beclin1),凋亡相关指标主要于梗死中心皮层明显变化(如cleaved Caspase-3及bax上调,bcl2下调),且Beclin1及Caspase-3进行双标免疫荧光染色时未见共标。说明应分区讨论于是取不同部位皮层进行蛋白及基因水平检测。Sal B可于pericore区抑LC3II及beclin1表达,但p62表达也减少并未堆积,说明自噬水平虽然降低,但自噬溶酶体仍能降解底物,说明Sal B抑制了过度激活的自噬水平。Sirt1-PGC-1α也在此区域明显激活,有利于能量代谢顺利进行,减少损伤的线粒体,从而减低自噬的刺激物。自噬水平的降低可能是由于Sirt1-PGC-1α激活致使ROS生成减少所致。Sal B可于core区抑制凋亡,bax/bcl2及cleaved Caspase-3下调。此抗凋亡作用可能是通过p-erk1/2及p-p38的蛋白表达下调所致。