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肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)和额颞叶变性(frontotemporal lobar degeneration,FTLD)是两类具有类似临床和病理表征的神经退行性疾病,主要病理特征为神经元退化(神经元死亡和功能丧失),脊髓或大脑皮层神经元中检测到不可溶的蛋白包涵体。包涵体中含有泛素化和磷酸化修饰的RNA结合蛋白TDP-43,及TDP-43的羧基端片段(CTFs)。一般认为TDP-43的这些病理改变(蛋白病变)是造成神经元退行性变的关键因素。TDP-43转基因小鼠表现为类似于ALS的症状,并能检测到TDP-43蛋白羧基端降解片段,但包涵体的形成并不明显。生理条件下RNA结合蛋白TDP-43在细胞核中广泛参与mRNA的剪接、稳定性及转运等过程,而ALS/FTLD病人及疾病模型中TDP-43呈现显著的胞浆分布(nucleo-cytosolic translocation)以及包涵体的形成,并导致RNA代谢异常以及神经细胞功能障碍。对于TDP-43转基因果蝇模型的研究发现,TDP-43介导的神经毒性依赖于其RNA结合功能,提示RNA也可能通过调控TDP-43参与这两种疾病的发生发展过程。此外,TDP-43核浆分布改变与病理性修饰及羧基片段形成的因果关系尚不清楚。本研究探索了RNA调控TDP-43蛋白病变的作用和相关机制。长非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的RNA,不编码蛋白质,直接以RNA的形式发挥功能。较蛋白编码基因相比,其序列保守性较差且表达丰度较低,通常具有更为特异的时空表达谱。LncRNA可在不同水平调控基因的表达,例如参与染色质修饰和重塑,调控转录、mRNA的剪接、稳定性和翻译等过程,但其影响蛋白修饰的报道较少。目前尚不清楚lncRNA是否在上述两种TDP-43介导的神经退行性疾病中也发挥相应作用。实验室前期应用转录组分析和原位杂交系统筛选了可能在小鼠大脑皮层发育和神经系统疾病中发挥功能的lncRNA,其中lncRNA-Dubr在大脑皮层发育中呈现时空特异性表达:在投射神经元发生的高峰期高表达,定位于发育中皮层的脑室下区(SVZ),与中间神经前体细胞分子标记物TBR2有显著定位。为了研究Dubr在小鼠发育特别是神经系统发育及其相关疾病中的功能,利用CRISPR/Cas9技术构建了Dubr全身敲除小鼠,发现Dubr的缺失对胚胎期小鼠的发育和存活以及大脑皮层发育无明显影响,但会导致小鼠出生后发育迟缓。免疫荧光染色发现敲除Dubr会特异性导致新生小鼠扣带回皮层和运动皮层部分神经元凋亡;此外,Dubr的缺失还会造成新生小鼠大脑皮层深层神经元尼氏小体发生溶解,着色减弱,提示该区域神经元出现功能异常。进一步对成年小鼠进行高尔基染色,发现Dubr的缺失会造成扣带回皮层神经元树突棘密度显著降低,长度减少;尼氏染色发现小鼠大脑皮层椎体神经元和小脑浦肯野细胞胞体呈空泡状,尼氏小体着色明显变浅;同时发现脊髓腹角运动神经元和脑干面神经核、迷走神经核及舌下神经核神经元数目不受影响,但这些神经核团神经元尼氏小体脱失。成年小鼠中枢神经系统未检测到细胞坏死和胶质细胞浸润。我们推测与呼吸、吞咽和咀嚼功能相关神经元的功能异常导致了小鼠出生后发育迟缓。为探索Dubr调控上述特定区域神经元存活和生理功能的分子机制,我们利用RNA pull-down联合质谱分析鉴定与Dubr相互作用的蛋白,发现Dubr能够与ALS/FTLD发病关键蛋白TDP-43相结合,该相互作用依赖于TDP-43的RRM1结构域。进一步通过紫外交联免疫共沉淀(CLIP)证实了TDP-43与Dubr之间的特异性相互作用。应用单分子荧光原位杂交结合免疫荧光染色发现Dubr与TDP-43在细胞核中具有良好的共定位关系。TDP-43与Dubr在转录水平上并无相互调控关系。在Dubr敲除小鼠神经系统中未检测到TDP-43包涵体的形成,以及核浆分布的改变;但Dubr的缺失会导致新生小鼠大脑皮层TDP-43羧基端片段明显增多。上述结果提示Dubr能够保护TDP-43不产生羧基端毒性片段,而且Dubr缺失导致的TDP-43羧基端产生不依赖其核定位的改变。人DUBR与鼠Dubr在基因组位置上具有较强保守性,两者基因组邻近编码基因完全相同。DUBR主要分布于细胞核中。DUBR与TDP-43也存在特异性相互作用,但依赖于TDP-43羧基端的甘氨酸富集结构域。我们进一步在细胞水平探索了DUBR调控TDP-43的分子机制,发现在人源神经系细胞H4和SK-N-SH中下调DUBR的表达均能导致TDP-43 25 kDa和35 kDa羧基端片段显著增多,同时细胞内活化的Caspase-3水平显著上调,提示DUBR的下调会通过增强TDP-43的毒性导致细胞凋亡。星形孢菌素是蛋白激酶C的抑制剂,处理细胞后能够诱导TDP-43羧基端片段的产生以及细胞死亡,而过表达DUBR能显著抑制这种羧基端片段的生成。突变分析发现人DUBR中与小鼠Dubr保守的268个碱基序列对TDP-43的保护作用是必需的。上述研究揭示了一个进化上保守的长非编码RNA-DUBR调控神经退行性疾病关键蛋白TDP-43的新机制,丰富了对lncRNA功能和作用方式的认识,对ALS/FTLD的防治提供了新的思路。