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目的丙烯酰胺(Acrylamide, ACR)是一种被广泛应用于工业生产的化工原料,除生产和使用ACR过程中的职业暴露外,淀粉类食品在高温(>120℃)烹调下也可产生微量ACR。动物实验和人群流行病学资料均已表明,ACR中毒以对神经系统的损害为主,引起感觉-运动型周围及中枢神经病变,ACR的神经毒性已被人们所认识。相关研究报道,ACR可对神经丝(Neurofilaments, NFs)造成损伤,病理结果显示ACR中毒模型轴突肿胀、NFs堆积。NFs是神经元细胞骨架的主要成分,由NF-L、NF-M、NF-H三种亚单位组成,其中任何一种NFs亚单位表达缺失或者表达过度,都可导致NFs结构或功能紊乱,引起轴浆运输发生改变,形成轴索病。ACR还可介导神经组织细胞内Ca2+浓度升高,细胞内Ca2+浓度超载可激活钙蛋白酶(Calpain)活性。但是上述改变之间的联系及发病机制,尚未研究清楚。假设ACR引起NFs改变与Calpain活性发生改变有关,本实验以神经干细胞(Neural Stem Cells, NSCs)为实验对象,建立ACR中毒及钙蛋白酶抑制剂(Calpeptin, CP)干预模型,测定细胞内Ca2+浓度、Calpain活性,以及NFs含量的变化,探讨ACR神经中毒的发病机制,为预防和治疗ACR中毒提供理论依据。方法1. NSCs的原代培养及鉴定无菌条件下,取出生24h内Wistar大乳鼠的脊髓背根神经节(Dorsal Root Ganglion, DRG)进行体外细胞原代培养。采用免疫荧光化学染色法检测NSCs特异性表达物巢蛋白(Nestin),神经元特异性表达物神经元特异性烯醇化酶(Neuron Specific Enolase,NSE),神经胶质细胞特异性表达物胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)进行NSCs鉴定。2.ACR中毒及CP干预模型的建立MTT法测定0D值,计算细胞存活率,逐步确定ACR中毒剂量与CP干预剂量,建立ACR中毒及CP干预模型。3.细胞内Ca2+浓度及Calpain活性的测定Fura-2/AM探针负载法和Calpain Substrate Ⅱ底物剩余法分别测定细胞内Ca2+浓度及Calpain活性。4.NFs含量的测定聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白免疫印迹法(Western Blotting)测定NFs含量。5.统计处理采用SPSS 19.0软件进行统计学分析,多组之间比较采用单因素方差分析,组间两两比较用Dunnett-t检验(方差齐)和Games-Howell检验(方差不齐)进行比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果1. NSCs的原代培养及鉴定NSCs的原代细胞经体外培养,细胞贴壁生长旺盛,7-10d可长满25cm2细胞培养瓶底部。免疫荧光化学染色法结果显示, 原代培养的NSCs Nestin染色呈阳性,且纯度可达90%以上。相同来源的细胞可由1μ mol/L.的维生素A诱导分化成NSE阳性的神经元和GFAP阳性的神经胶质细胞。2.ARC中毒及CP干预模型的建立与对照组比较：ACR组(筛选浓度760 μ mol/L).CP组(筛选浓度4 μmol/ L)、ACR+CP组(ACR 760μ mol/L+CP 4μ mol/L)OD值均低于对照组,其中ACR组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与ACR组比较：各组0D值均高于ACR组,其中与ACR+CP组比较,差异有统计学意义(P<0.05)3.细胞内Ca2+浓度的测定与对照组比较：ACR组、ACR+CP组细胞内Ca2+浓度分别升高了47.5%、12.4%(P<0.05)。CP组细胞内Ca2+浓度降低了2.7%(P>0.05)。与ACR组比较：ACR+CP组细胞内Ca2+浓度降低了23.8%(P<0.05)。4.Calpain活性的测定与对照组比较：ACR组Calpain活性升高了23.6%(P<0.05),CP组、ACR+CP组Calpain活性分别降低了2.8%、4.1%(P>O.05)。与ACR组比较：ACR+CP组Calpain活性降低了22.4%(P<0.05)。5.NFs含量的测定与对照组比较,CP组、ACR组、ACR+CP组NF-L, NF-M, NF-H含量均升高。ACR 组 NF-L, NF-M, NF-H分别升高了60.92％、48.31％,35.84％(P<0.05)。ACR+CP组NF-L升高了19.87％(P<0.05), NF-M, NF-H分别升高了6.01%,10.21%(P>0.05)。与ACR组比较,ACR+CP组NF-L, NF-M,NF-H分别降低了25.51%、28.52%,18.87%(P<0.05)。结论1.成功建立了以NSCs为受试对象的ACR中毒及CP干预模型。2.CP可有效干预ACR引起的NSCs存活率、Ca卦浓度、Calpain活性、NFs含量的变化。3.ACR引起NFs变化与Calpain活性改变有关,CP通过抑制Calpain活性对ACR引起的NFs损伤产生保护作用。