猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以母猪发生繁殖障碍和仔猪出现呼吸道症状为特征的传染性疾病。本病于20世纪80年代首发于美国,1990年6月在欧洲出现,中国于1995年发生该病。目前,全世界所有养猪的国家和地区均有本病的发生与流行,并引起巨大的经济损失。从河南省某发病猪场临床组织样本中分离到1株北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒,命名为PRRSV HN-08株。对PRRSV HN-08株进行生物学特性研究表明,该病毒粒子呈球形,直径约50 nm,为RNA病毒;可在Marc-145细胞中稳定传代,并产生明显CPE;可与PRRSV荧光抗体结合,产生特异性荧光;可被美洲型PRRSV阳性血清特异性中和;对热、酸、碱、氯仿等敏感。对猪的致病性试验表明,与我国早期PRRSV分离株相比,该毒株对猪的致病力明显增强,接种后对其血清及剖检病料进行病原检测结果表明,该PRRSV变异株在猪体内增殖速度增快,病毒血症持续时间延长,在体内分布范围更广。为了解我国不同地区PRRSV分离株间的遗传变异关系,本研究对2005—2008年间分离自中国部分省区的37株PRRSV分离株的ORF5基因和Nsp2基因进行了分子流行病学研究。GP5具有较高的免疫原性和中和活性,在环境和免疫压力作用下极易发生变异。对包括14株参考毒株在内的51株PRRSV GP5序列分析表明,所分离的37株PRRSV均为北美洲型;ORF5基因序列间同源性为85.6%~99.5%,说明PRRSV分离株ORF5基因区域变异较大,具有年度特征;不同地区PRRSV分离株遗传关系存在交叉现象,地域特征不明显。29株Nsp2变异株主要中和表位PNE序列中L39全部突变为I39,潜在的毒力相关位点与强毒株(VR-2332株、CH-1a株)相同,所有PRRSV分离株诱骗表位均极为保守。Nsp2蛋白具有极强的抗原性,在37株PRRSV分离株中,有8株未发生Nsp2基因缺失,多分离于2005年;29株Nsp2基因缺失株均分离于2006年下半年至2008年,说明目前PRRSV优势流行毒株在Nsp2区域变异较大,发生了部分缺失,但缺失的氨基酸并不影响病毒的增殖。系统分析表明,目前我国田间使用的弱毒疫苗与PRRSV分离株亲缘关系较远。对PRRSV HN-08株的全基因组进行序列测定和结果分析表明,该毒株与我国2006—2007年间多个省份分离的高致病性PRRSV变异株的各蛋白氨基酸序列具有高度同源性,且遗传变异特征相同,推测可能来源于同一祖先。PRRSV为RNA病毒,在体外难于进行基因操作。应用反向遗传操作技术,将基因组RNA转换为cDNA,在DNA水平上对病毒进行基因操作。本研究就PRRSV体内拯救系统的建立进行了初步探讨。根据PRRSV基因组和克隆载体的限制性酶切位点,将PRRSV基因组分为4段进行反转录和扩增(RT-PCR),将得到的片段经过一系列的克隆和亚克隆后,获得了基因组全长cDNA克隆。在基因组5`端引入PⅡ、PⅠ和榔头锤酶,在基因组3`端引入戊肝核酶、TⅠ和TⅡ序列,获得了含有PRRSV HN-08株基因组全长cDNA的重组质粒pPⅠT7PⅡ-HN08。将该重组质粒进行全基因序列测定,未发现致死性突变。转染Marc-145细胞后对拯救病毒进行鉴定表明,该拯救系统可能没有转录出完整的病毒基因组或转录出的病毒基因组没有感染性,或虽然拯救出了PRRSV,但拯救效率较低。构建基因组全长cDNA克隆是构建感染性分子克隆的关键一步,但获得的cDNA克隆不一定具有感染性。在本试验中构建的基因组全长cDNA克隆为进一步获得具有感染性的PRRSV分子克隆并研究该病毒基因组的结构和功能奠定了基础。