胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤。近年来胰腺癌的发病率和死亡率呈现明显的上升趋势,其恶性程度高,侵袭能力强,是预后最差的恶性肿瘤之一。据统计,在经济发达地区以及工业化程度偏高的地区,胰腺癌的发病率明显偏高,美国胰腺癌的致死率位于恶性肿瘤中的第四位。在中国,随着经济的飞速发展,环境的不断恶化以及人们生活方式的改变,胰腺癌的发病率也呈现逐年上升趋势。虽然已经存在大量与胰腺癌相关的科研与临床研究,但是由于其早期发病症状不易被发现并且发病快,手术切除率低,复发性高等特点,胰腺癌已然成为了全世界十大恶性肿瘤之一。正是由于胰腺癌所具有的这些巨大的危害,对于胰腺癌发病机制的研究,对于胰腺癌早期发病诊断的探索,对于胰腺癌药物作用靶点的寻找,对于治疗胰腺癌的特异性药物,成为了广大科学工作者所要面临的重大挑战和任务。胰腺癌以生长迅速并早期发生转移为特征,其病因及发病机理至今不明。随着肿瘤学和分子生物学研究的不断进步,使肿瘤的发病机制日益受到人们的重视,成为了全球生物医学工作者研究的热点。大量的研究表明,胰腺癌细胞与细胞周围微环境之间的信号传导途径,在胰腺癌细胞的生长,增殖,血管生成,迁移,侵袭和转移中都起着至关重要的作用。并且在很大程度上,信号转导途径是通过所包含的膜蛋白将肿瘤细胞外的信号转导入细胞内从而产生一系列的效应。许多的研究报道都发现,G蛋白偶联受体介导的信号通路中各个信号分子的的异常性表达、突变以及失调都在恶性肿瘤的发生发展中有着至关重要的作用。其中GPCRs是细胞表面最大的参与信号传输的分子家族,这些受体能够调节多种细胞功能,在细胞信号转导,调控细胞增殖和迁移以及基因转录等方面都起着至关重要的作用。最近研究证实GPCRs已成为肿瘤生长和转移的关键因素,能有效的调节血管再生以及新陈代谢。恶性肿瘤细胞通常会损害GPCRs的正常生理功能,使肿瘤细胞能够自主进行生存,繁殖,躲避免疫系统,增强血液的供应以及侵入周围的正常组织以至于传播到其他的器官中。GPCRs是原癌基因信号分子的关键调控蛋白,参与着许多癌症的发生和发展,包括胃癌,大肠癌,前列腺癌,乳腺癌,肺癌,肝癌等多种常见的恶性肿瘤,是当前热门的癌症治疗药物作用靶点。GPR137是由同源性筛查发现的,一种新颖的G蛋白偶联受体。GPR137基因,位于人的第11号染色体上,并编码一个包含325个氨基酸的孤儿G蛋白受体。GPR137基因在中枢神经系统中大量表达,在结构上GPR137基因与前列腺特异气味型孤儿G蛋白偶联受体(PSGR)高度同源。研究表明,PSGR在人类前列腺组织中限制性表达,并且已经作为前列腺癌症的诊断标记物。另外,越来越多的研究也证实GPR137基因参与体内一些如肝癌、乳腺癌等肿瘤的形成过程。但是该基因在胰腺癌中的生理作用尚未有报道。目的mRNA可以被小干扰RNA (siRNA)特异性的降解,从而目的基因会发生转录后沉默,这种生物技术即为RNA干扰技术。这种RNA干扰现象在自然界中广泛的存在,通过这种机制可以使得在进化过程中的生物体形成一种有效的抵御所受到的外来基因的侵害,这样的抵御外来侵害机制在生物体进化过程中稳定基因组免受外来侵害中担任了非常重要的角色。RNA干扰技术能够敲除和关闭研究者实验所需要的特定基因的表达,并具有特异性高、敲除率强等优点在近年来被广泛地应用在各个基因功能探索和检测实验中,尤其是在恶性肿瘤治疗领域。因此在本课题中,我们运用RNA干扰技术特异性的敲除GPR137基因表达,研究其在胰腺癌细胞中的功能表型变化,并进一步探索GPR137引发胰腺癌可能的分子机制。首先,我们通过对胰腺癌临床相关性研究,分析比较在正常癌旁胰腺组织组织和胰腺癌组织中GPR137的表达情况,发现胰腺癌组织内GPR137表达水平均出现上调,接下来为了进一步探究GPR137对于胰腺癌发生发展的重要性,我们构建了GPR137基因的慢病毒敲减和过表达载体,包装成病毒颗粒并感染人胰腺癌细胞系BXPC-3和PANC-1,采用实时定量聚合酶链式反应和Western印迹法验证GPR137基因的mRNA和蛋白的表达,确定其抑制效率。随后,我们检测了细胞的增殖迁移的能力,包括噻唑蓝(MTT)比色实验细胞,克隆形成等实验、。同时实验还运用了流式细胞分析实检测了胰腺癌细胞中转染GPR137-RNAi慢病毒载体后胰腺癌细胞的周期分布情况,观察并分析了敲除GPR137基因后,对恶性胰腺癌细胞增殖、克隆形成和周期分布的影响。结果表明,GPR137-RNAi能有效抑制胰腺癌细胞中GPR137基因的mRNA和蛋白的表达,感染后的胰腺癌细胞的增殖和克隆形成能力明显的受到抑制,说明GPR137在胰腺癌的发生发展中发挥着重要的作用。流式细胞仪的分析表明敲除胰腺癌细胞的GPR137基因后,细胞周期阻滞于亚G1期,并且凋亡细胞显著增加。此外,Western印迹法检测表明GPR137基因的沉默是通过PARP的活化和Caspase-3的上调来诱导细胞凋亡。综上所述,GPR137基因在体外对胰腺癌细胞的增殖、克隆形成具有重要影响,同时,GPR137基因作为潜在的靶向基因,为胰腺癌的治疗研究提供了有力的理论依据和前景展望。第一部分GPR137与胰腺癌的临床相关性研究[研究目的]通过对胰腺癌临床相关性研究,分析比较在正常癌旁胰腺组织组织和胰腺癌组织中GPR137的表达情况[研究方法](1) 免疫组织化学法比较了41例胰腺癌组织和癌旁胰腺组织,GPR137在胰腺癌和癌旁胰腺组织组织中的表达情况区别[结果](1)GPR137在胰腺癌组织和癌旁胰腺组织中的表达情况。20例呈阳性表达,1例呈弱阳性表达或无阳性表达。GPR137在胰腺癌组织中的表达显著高于癌旁胰腺组织。[结论]本部分免疫组化实验结果表明了GPR137在胰腺癌组织中的表达显著高于癌旁胰腺组织,实验结果虽然跟患者的年龄,性别,分期等没有什么显著性的差异,这可能由于样本量少的原因。根据本实验结果中胰腺癌组织内GPR137表达水平均出现上调,可以推断GPR137在胰腺癌发生发展中的重要性。GPR137基因的沉默是通过PARP的活化和Caspase-3的上调来诱导细胞凋亡。综上所述,GPR137基因在体外对胰腺癌细胞的增殖、克隆形成具有重要影响,同时,GPR137基因作为潜在的靶向基因,为胰腺癌的治疗研究提供了有力的理论依据和前景展望。第一部分GPR137与胰腺癌的临床相关性研究[研究目的]通过对胰腺癌临床相关性研究,分析比较在正常癌旁胰腺组织组织和胰腺癌组织中GPR137的表达情况[研究方法](1) 免疫组织化学法比较了41例胰腺癌组织和癌旁胰腺组织,GPR137在胰腺癌和癌旁胰腺组织组织中的表达情况区别[结果](1)GPR137在胰腺癌组织和癌旁胰腺组织中的表达情况。20例呈阳性表达,1例呈弱阳性表达或无阳性表达。GPR137在胰腺癌组织中的表达显著高于癌旁胰腺组织。[结论]本部分免疫组化实验结果表明了GPR137在胰腺癌组织中的表达显著高于癌旁胰腺组织,实验结果虽然跟患者的年龄,性别,分期等没有什么显著性的差异,这可能由于样本量少的原因。根据本实验结果中胰腺癌组织内GPR137表达水平均出现上调,可以推断GPR137在胰腺癌发生发展中的重要性。第二部分GPR137-RNAi慢病毒表达载体构建和包装[研究目的]GPR137-RNAi’漫病毒载体的构建和包装,沉默胰腺癌细胞中GPR137基因的表达,为接下来的GPR137在胰腺癌细胞中的研究奠定实验基础。[研究方法](1)根据GenBank提供的GPR137的mRNA靶基因序列,设计并合成4对GPR137特异的siRNA。(2)4组GPR137慢病毒敲减和过表达载体的构建,并分别测序检测。(3)慢病毒包装实验,并通过荧光显微镜观察转染效率和滴度检测。[结果](1)根据设计原则,成功设计并合成了4对针对GPR137基因的siRNA。(2)成功地构建了4组GPR137慢病毒敲减和过表达地载体。(3) GPR137-RNAi慢病毒转染48小时后,在荧光显微镜下观察,可见被病毒感染的细胞呈绿色荧光,转染效率大于90%,证明转染成功。随后滴度测定显示细胞感染效率接近100%。[结论]本实验根据网上在线设计siRNA的软件,遵循RNAi设计原则,最终以慢病毒为载体构建了4条针对GPR137基因的干扰片段,并通过荧光检测其转染效率大于90%,滴度检测为为1.0E+07 TU/ml,成功构建了针对目的基因GPR137的慢病毒载体,为下一步GPR137基因的研究提供了实验基础。(1)根据设计原则,成功设计并合成了4对针对GPR137基因的siRNA。(2)成功地构建了4组GPR137慢病毒敲减和过表达地载体。(3) GPR137-RNAi慢病毒转染48小时后,在荧光显微镜下观察,可见被病毒感染的细胞呈绿色荧光,转染效率大于90%,证明转染成功。随后滴度测定显示细胞感染效率接近100%。[结论]本实验根据网上在线设计siRNA的软件,遵循RNAi设计原则,最终以慢病毒为载体构建了4条针对GPR137基因的干扰片段,并通过荧光检测其转染效率大于90%,滴度检测为为1.0E+07 TU/ml,成功构建了针对目的基因GPR137的慢病毒载体,为下一步GPR137基因的研究提供了实验基础。第三部分GPR137在胰腺癌细胞中的功能表型研究[研究目的]通过各种功能检测实验,检测敲除GPR137后胰腺癌细胞功能表型的变化,确定GPR137与胰腺癌发生发展的重要性。[研究方法](1)慢病毒感染实验,荧光观察GPR137-RNAi慢病毒载体的感染效率。(2)运用qRT-PCR方法检测GPR137-RNAi慢病毒载体在mRNA层面上对GPR137基因的敲减效率。(3)运用MTT细胞增殖实验检测了敲除GPR137后胰腺癌细胞增殖情况的变化。(4)运用克隆形成实验检测了敲除GPR137后胰腺癌细胞克隆形成能力的变化。(5)运用流式细胞仪方法检测了敲除GPR137后胰腺癌细胞周期的变化情况。(6)运用Annexin V和7-AAD对联合染色检测Lv-shGPR137对细胞凋亡情况的影响。[结果](1)用构建好的慢病毒表达载体Lv-shCon和Lv-shGPR137去感染两株人胰腺癌细胞BXPC-3及PANC-1,荧光显微镜下观察发现,在BXPC-3中,慢病毒表达载体Lv-shCon和Lv-shGPR137的感染效率很高,达到90%以上；在PANC-1中,所构建的慢病毒表达载体依然有很高的感染效率,约为80%左右。(2) BXPC-3和PANC-1细胞在感染Lv-shGPR137 48h后提RNA进行qRT-PCR检测,GPR137敲减组比对照组的mRNA水平均降低了将近80%。(3)在BXPC-3、PANC-1中进行MTT细胞增殖实验,Lv-shGPR137几乎完全抑制了胰腺癌细胞的生长。(4) BXPC-3细胞感染Lv-shGPR137后稀释成单个细胞进行培养,观察发现Lv-shGPR137可以明显抑制BXPC-3细胞的克隆形成能力。(5)用BXPC-3细胞进行细胞周期实验,BXPC-3细胞的细胞周期发生了明显的变化,其处于G0/G1的细胞下降到细胞总数的50%左右,而处在S期的细胞数量则明显上升,达到了35%,三组细胞处于G2/M期的细胞数量差异不大。(6) BXPC-3细胞在感染了Lv-shGPR137后,其活细胞数量明显减少,约占总数的8%,处于早期凋亡的的细胞数量上升不明显,大约为细胞总数的17%,而晚期凋亡的细胞数量则急剧增多,接近70%。[结论]成功构建了GPR137-RNAi的慢病毒载体并转染入胰腺癌细胞中,通过沉默胰腺癌细胞中的GPR137基因的表达,探究GPR137缺失前后胰腺癌细胞功能表型的变化,结果表明GPR137在胰腺癌细胞中能明显抑制细胞的增殖和迁移,促进细胞的凋亡。(3)在BXPC-3、PANC-1中进行MTT细胞增殖实验,Lv-shGPR137几乎完全抑制了胰腺癌细胞的生长。(4) BXPC-3细胞感染Lv-shGPR137后稀释成单个细胞进行培养,观察发现Lv-shGPR137可以明显抑制BXPC-3细胞的克隆形成能力。(5)用BXPC-3细胞进行细胞周期实验,BXPC-3细胞的细胞周期发生了明显的变化,其处于G0/G1的细胞下降到细胞总数的50%左右,而处在S期的细胞数量则明显上升,达到了35%,三组细胞处于G2/M期的细胞数量差异不大。(6) BXPC-3细胞在感染了Lv-shGPR137后,其活细胞数量明显减少,约占总数的8%,处于早期凋亡的的细胞数量上升不明显,大约为细胞总数的17%,而晚期凋亡的细胞数量则急剧增多,接近70%。[结论]成功构建了GPR137-RNAi的慢病毒载体并转染入胰腺癌细胞中,通过沉默胰腺癌细胞中的GPR137基因的表达,探究GPR137缺失前后胰腺癌细胞功能表型的变化,结果表明GPR137在胰腺癌细胞中能明显抑制细胞的增殖和迁移,促进细胞的凋亡。第四部分 GPR137在胰腺癌细胞中的分子机制研究[研究目的]对可能调控胰腺癌细胞的增殖抑制及促凋亡的分子机制和关键的蛋白的研究。[研究方法]运用Western Blot技术检测抑制GPR137对胰腺癌细胞凋亡相关蛋白的表达情况改变[结果]在敲除GPR137的胰腺癌细胞中,PARP蛋白发生了活化,Caspase-3蛋白发生了上调,提示PARP和Caspase-3在抑制GPR137诱导胰腺癌细胞凋亡中发挥了重要的作用。[结论]在胰腺癌细胞中,抑制GPR137的表达后,PARP发生了明显的裂解激活现象,而Caspase-3的表达也明显增强,说明了胰腺癌细胞发生了明显凋亡,并且可能是由于PARP的裂解激活和Caspase-3的上调所导致的。本实验对GPR137基因在胰腺癌中抑制细胞增殖和迁移、促进细胞凋亡的分子机制做了初步的探讨,为寻找胰腺癌新的诊断标志物和药物作用靶标提供了理论基础和实验依据。