前言人睾丸精子结合蛋白基因（testis sperm binding protein，TSBP）是本实验室在人睾丸组织中克隆的一个与牛精浆蛋白（bovine seminal plasma proteins，BSP）相关的精子结合蛋白新基因，其编码的蛋白质与BSP蛋白在结构上有一定的相似性，预测该蛋白是BSP蛋白功能相关的精子结合蛋白。BSP蛋白是牛精浆中的主要蛋白质，其功能研究备受关注，研究表明，BSP蛋白在精子胞膜的脂类代谢、调节精子获能及顶体反应等方面发挥重要作用。在猪和马的精浆中都发现了BSP同源蛋白质的存在，这些同源蛋白具有与BSP蛋白相似的结合特性，说明BSP蛋白及其同源蛋白在哺乳动物中是广泛存在的，而在人的精浆中其同源蛋白的发现未见报道。蛋白质酪氨酸磷酸化增加是精子获能的一个重要表现，在人精子中，蛋白质酪氨酸磷酸化的增加是受cAMP／PICA信号途径调节的，因此精子获能极有可能与PKA途径有关。BSP可以促进精子膜胆固醇的流失，精子膜组分的重排有利于HCO₃^-和Ca²⁺内流，两者激活精子膜上的腺苷酸环化酶（AC），AC促进cAMP合成，依次激活PKA，通过酪氨酸蛋白激酶和磷酸酪氨酸磷酸酶的双重调节而促进蛋白质酪氨酸磷酸化，最终引起获能。为了研究TSBP与PKA活性之间的关系，我们利用真核重组表达质粒pcDNA3.1／myc-His（-）B／tsbp转染人胚肾HEK293细胞系，通过G418筛选出药物抗性克隆，建立了稳定的真核表达细胞系。用放射自显影法检测了稳定转染细胞系中PKA的活性，结果表明TSBP蛋白对PKA具有活化作用，表明TSBP与BSP蛋白一样，可能通过cAMP／PKA途径调节精子获能。在前期研究中我们已对该基因进行了原核表达，原核表达系统具有表达效率高，操作方便等特点，但缺乏翻译后修饰，为了得到与人体内功能相近的重组蛋白，进一步研究该蛋白对精子获能及顶体反应的影响，则需要应用基因克隆技术获得该基因真核细胞表达的重组蛋白。基于建立的融合蛋白表达载体pcDNA3.1／myc-His（-）B／tsbp稳定转染的HEK293细胞系，本研究利用Ni²⁺-NTA金属亲和层析柱对目的蛋白进行了分离纯化，获得的重组蛋白用于下一步该基因功能的研究。精子在体内只有经过获能、顶体反应，才能穿入卵细胞与其融合，完成受精；同时，精子膜的功能与精子获能、顶体反应及精卵融合密切相关。因此，检测精子的顶体功能及精子膜功能的完整性可准确地反映精子功能，并预测精子的潜在受精能力。牛精浆蛋白BSP所具有的Ⅱ型结构特点，形成多聚体结构，可与精子表面的磷脂结合，促进肝素和HDL诱发的牛附睾精子获能。BSP蛋白还可与不同来源的胶原、纤维蛋白原、肝素、钙调蛋白、IGF、apo-等结合，还可以抑制精子细胞膜上的胆固醇迁移。TSBP是与BSP蛋白相关的精子结合蛋白新基因，与BSP蛋白在结构上有一定的相似性，为了进一步探讨TSBP在相关方面的生物学功能，我们检测了重组的TSBP融合蛋白对精子各方面功能的影响，包括精子的获能、膜功能、运动性能以及精子蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC）的活性等。材料与方法1、材料与试剂质粒pcDNA3.1／myc-His（-）B、重组质粒pGEX-5X-1／tsbp和HEK293细胞，均由本室保存。大肠杆菌JM109感受态细胞、PCR扩增试剂盒、限制性内切酶BamHⅠ及XhoⅠ、质粒DNA快速抽提纯化试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒、动物RNAout、RT-PCR试剂盒均购自Takara公司。无内毒素超纯质粒纯化试剂盒购自V-Gene公司。琼脂糖、pGEM-T Easy载体系统、DNA连接试剂盒、G418（GENETICIN）购自Promega公司。LB培养基、脂质体转染试剂LipofectamineTM2000、抗His6抗体、Ni²⁺-NTA纯化系统购自Invitrogen公司。AP、HRP或FITC标记山羊抗小鼠IgG、DAB试剂盒、AP显色试剂购自北京中杉。DMEM高糖培养基为HyClone公司产品。引物合成和DNA序列测定由Takara公司完成。其他常用试剂均参照《分子克隆实验指南》配制。[γ-³²p]ATP购自北京福瑞生物工程公司，其余激酶活性测定试剂均为Sigma公司产品，均为分析纯。新鲜人精液标本由辽宁省计划生育科研院生殖医学重点实验室提供。Percoll密度梯度离心液购自Sigma公司。HSA购自Sigma公司。台盼蓝购自Chroma。俾士麦棕由Schmid H生产，上海化学试剂厂分装。四氯四碘荧光素B（玫瑰红）购自Fluka公司。孕酮购自天津金耀氨基酸公司。2、TSBP基因真核表达质粒的构建以pGEX-5X-1／tsbp上克隆的TSBP为模板，用其特异引物PCR扩增，克隆到pGEM-T Easy载体上；选用真核表达载体pcDNA3.1／myc-His（-）B与pGEM-T Easy／tsbp同时用BamHⅠ及XhoⅠ双酶切，进行分离、纯化、连接，获得重组pcDNA3.1／myc-His（-）B／tsbp质粒，对重组载体进行双向测序。3、真核转染细胞系的建立分别以重组载体pcDNA3.1／myc-His（-）B／tsbp和空载体peDNA3.1／myc-His（-）B转染HEK293细胞，经G418筛选，获得稳定表达真核细胞系。用RT-PCR、细胞免疫荧光及Western blot等方法检测未转染及各转染细胞系内TSBP蛋白的表达情况。4、金属亲和层析纯化融合蛋白用Invitrogen Ni²⁺-NTA纯化系统试剂盒中提供的上样缓冲液收集细胞后反复冻融裂解，离心后保存上清。按纯化系统说明书进行纯化，分别保留上样液、流出液和洗脱液。超滤浓缩洗脱液并将缓冲液更换为PBS。测定总蛋白量，并用SDS-PAGE及Western印迹检测纯化效果。5、重组His6-TSBP与人精子膜的结合精液样本液化后用Percoll密度梯度离心法分离精子，精子培养液中加入等体积超滤浓缩液。培养1 hr或3 hr后，提取精子膜组分，Western印迹检测重组His6-TSBP与人精子膜的结合情况。6、精子功能检测精液样本液化后用Percoll密度梯度离心法分离精子，每份处理后的精液样本均分为5组，即空白对照组、杂蛋白对照组、HSA获能组、低浓度重组TSBP（0.01mg／ml）处理组和高浓度重组TSBP（0.1 mg／ml）处理组。在培养1 hr和3 hr时分别检测各组精子的获能情况（三色法检测孕酮诱导的顶体反应率）、膜功能完整性（低渗肿胀率）及运动性能（计算机辅助精液分析）。7、蛋白激酶活性测定（1）PKA活性测定将稳定转染的细胞及未转染和空质粒转染的对照组细胞（或“6”中经不同处理的精子样本）分别加入裂解缓冲液，将裂解物离心后收集上清。分别加入PKA反应液，37℃水浴30 min后，SDS-PAGE将肯普肽分离出来，晾干后放射自显影，凝胶分析系统读取肯普肽相应自显影带，代表PKA的活性。（2）PKC活性测定检测“6”中经不同处理的精子样本中的PKC活性，方法同PKA的活性测定，将底物肯普肽替换为PKC特异性底物MARCKS。实验结果1、真核表达载体的构建构建的真核表达载体pcDNA3.1／myc-His（-）B／tsbp扩增后用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳后显示与预期大小相同的tsbp片段（750bp）及5.5 kb的载体片段。进一步DNA测序结果显示插入片段与tsbp编码序列一致，阅读框架完整，并且无移码。即所构建的真核重组质粒的表达产物带有组氨酸标签，可用于蛋白的纯化和鉴定。2、重组TSBP蛋白的表达提取各组细胞内的总RNA后，经反转录以tsbp基因的特异性引物进行PCR，结果在转染组细胞内检测到了750 bp的tsbp基因片段，而在未转染及空质粒转染组则未检测到该片段。以FITC标记的山羊抗小鼠IgG，应用细胞免疫荧光方法，在转染组细胞内观察到了绿色荧光信号，而在未转染组细胞则未观察到该信号。Western blot的检测结果与RT-PCR及细胞免疫荧光的结果相一致，即在转染细胞的裂解液中检测到了30 kDa的融合蛋白His6-TSBP，而在未转染及空质粒转染组则未检测到His6融合蛋白的表达。3、重组TSBP基因转染后细胞系中PKA的活性变化对转染重组载体pcDNA3.1／myc-His（-）B／tsbp、空载体pcDNA3.1／myc-His（-）B及未转染细胞分别用放射自显影法，以肯普肽为特异底物，检测PKA活性。结果转染重组载体pcDNA3.1／myc-His（-）B／tsbp的细胞中PKA活性明显高于空质粒转染组及未转染组细胞。4、重组TSBP蛋白纯化结果将金属亲和层析纯化后的上样液、流出液和洗脱液进行12％SDS-PAGE电泳。随着洗脱缓冲液pH的下降，Ni²⁺-NTA与组氨酸标签的亲和力降低，His6-TSBP融合蛋白被洗脱下来，pH 4.5的缓冲液可将大部分融合蛋白洗脱下来。洗脱液中在30 kDa左右有一条较为明显的蛋白条带，经Western blot进一步证实该条带为带有组氨酸标签的重组蛋白，即His6-TSBP。5、重组His6-TSBP与人精子膜的结合纯化后的重组His6-TSBP与人精子共培养后，Western印迹结果显示，在培养1 hr或3 hr后，精子膜上均有不同程度的重组蛋白结合。6、真核重组TSBP蛋白对精子功能的影响（1）对精子获能的影响各组精子经孕酮处理后，三色法染色，光学显微镜下观察顶体反应率。结果显示，0.1 mg／ml的重组TSBP蛋白组与空白组或杂蛋白组相比能显著提高孕酮诱导的顶体反应率（P＜0.05），低浓度重组TSBP（0.01 mg／ml）处理组的AR率较空白组有所提高，但无显著性差异。（2）对精子膜功能完整性的影响经22例精液样本分析，结果显示重组TSBP蛋白可以影响精子膜功能，高浓度处理组在1 hr及3 hr精子尾部低渗肿胀率分别达到（90±15）％和（94±18）％，与空白对照组相比具有显著性差异（P＜0.05），而低浓度处理组与空白对照组相比无显著性差异，说明重组TSBP蛋白对精子膜功能的作用受其浓度变化的影响。（3）对精子运动性能的影响培养后各组精子经计算机辅助精子运动分析（CASA），从各动态特征指标分析结果可以看出，重组TSBP蛋白在0.1 mg／ml时，处理1 hr后可以提高前向性运动百分率，与对照组相比具有显著性差异，但对整体的精子活动率无显著影响；在处理3 hr后，精子前向性运动百分率及活动率均有显著提高。其他处理组精子的前向性运动百分率及活动率与对照组相比均无明显差异。各处理组精子的VSL及VCL均无显著差异。7、重组TSBP蛋白对精子蛋白激酶活性的影响（1）对精子PKA活性的影响放射自显影结果表明，0.01 mg／ml重组TSBP蛋白培养组精子的PKA活性与对照组则无显著差异，而0.1 mg／ml重组TSBP蛋白培养组精子的PKA活性明显高于对照组。（2）对精子膜PKC活性的影响0.1 mg／ml重组TSBP蛋白处理人精子3 hr后，提取的精子膜组分中的PKC活性经放射自显影检测略高于对照组，但无显著性差异。讨论在研究牛精浆蛋白（bovine seminal plasma，BSP）及其相关蛋白在受精卵发育过程中的重要作用时，我们在人睾丸组织中发现并克隆了一个与BSP蛋白相关的新的精子结合蛋白基因的cDNA序列，将其命名为人睾丸精子结合蛋白基因（tsbp，testis sperm binding protein），并在GenBank注册，登陆号为AF279147。其开放阅读框架编码了一个含223个氨基酸残基的蛋白质，含有7个外显子、6个内含子及四个纤连蛋白Ⅱ型结构域，与BSP蛋白在结构上有一定的相似性，预测该蛋白是BSP蛋白功能相关的精子结合蛋白。在前期研究中我们已对该基因进行了原核表达并应用辐射杂种细胞系（RH）技术和荧光原位杂交确定tsbp基因定位于人19q1.3上。原核表达系统具有表达效率高，操作方便等特点，但缺乏翻译后修饰，为了得到与人体内功能相近的重组蛋白，需要应用基因克隆技术获得该基因真核细胞表达的重组蛋白。在目的蛋白一端融合组氨酸纯化标签是近几年表达重组蛋白的常用方法，由于多聚组氨酸亲和标签的分子量相对较小且带有电荷，因此，几乎不会影响蛋白质的活性，纯化产物可直接用于蛋白功能的研究。本研究利用IMAC对融合蛋白His6-TSBP分离纯化后，用Western blot分析显示，经过亲和层析纯化并超滤浓缩的目的蛋白得到富集。其中除组氨酸亲和层析纯化的产物外，尚有几条杂蛋白带，这可能是由于细胞培养上清中含有组氨酸、谷氨酰胺，以及大量牛血清成分，干扰了融合蛋白与Ni²⁺-NTA的结合所致。精子脂膜结构的改变是其获能过程中最为重要的变化之一，因此，检测精子的顶体反应功能及精子膜功能的完整性可准确地反映精子功能，并预测精子的潜在受精能力。1999年，WHO规定可将精子顶体反应率、精子膜功能完整性作为评价精子受精功能的重要指标。本研究检测了不同浓度的TSBP重组蛋白对精子膜功能完整性、孕酮诱导的顶体反应率及运动性能的影响。结果表明重组的TSBP蛋白与BSP蛋白类似，可以影响精子的受精能力。精子跨膜细胞信号转导与精子的活力密切相关，不同的细胞信号通过细胞信号转导通道引起精子鞭毛蛋白的磷酸化或去磷酸化来调节精子的活力。在体外，蛋白质酪氨酸磷酸化作用对胆固醇受体的存在有一定依赖性，提示胆固醇外流和蛋白质酪氨酸磷酸化之间存在一定关系。考虑到BSP与精子膜胆固醇外流及cAMP／PKA途径之间的相互关系，在本研究中我们探讨了其同源蛋白TSBP与PKA活性之间的作用，通过构建真核表达载体pcDNA3.1／myc-His（-）B／tsbp，稳定转染HEK293细胞后检测PKA的活性，发现与对照组相比重组TSBP蛋白对PKA有一定的激活作用。有学者指出，PKC存在于人精子中，参与鞭毛运动的调节。精子尾部轴丝与精子运动密切相关，目前已发现多种与轴丝微管有关的蛋白质，这些蛋白质是精子发生启动和维持运动所必需的，是PKC的底物。PKC可使蛋白质磷酸化，进而调节精子运动，PKC的活性及含量与精子的活力密切相关。在本研究中，我们发现重组TSBP蛋白可以提高人精子内PKA的活性，提示该蛋白在体内有可能通过该途径影响精子功能。但是必须注意的是，本研究所得的融合蛋白的浓度及作用环境与该蛋白的生理状态有一定差别，要进一步确定其生物学功能，还需要获得从组织中纯化的蛋白。结论1、建立了稳定的融合蛋白His6-TSBP真核表达细胞系。2、在有His6-TSBP融合蛋白表达的细胞系中，PKA的活性有所提高。3、对真核表达的His6-TSBP融合蛋白进行了金属亲和层析纯化。4、重组TSBP蛋白在体外可以与人精子膜结合。5、重组TSBP蛋白可以提高人精子的膜功能完整性和活动率，降低孕酮诱导的顶体反应率，提示TSBP可能与精子获能及顶体反应有关。6、重组TSBP蛋白在体外可以提高人精子中PKA的活性。7、重组TSBP蛋白在体外对人精子膜上PKC的活性无显著影响。