【摘 要】
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羊支原体性肺炎是由支原体引起的羊的呼吸系统疾病,主要的病原为丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种以及绵羊肺炎支原体,分别引起山羊的败血症、山羊传染性胸膜肺炎和绵羊支原体肺炎。对于羊支原体肺炎的防控,目前我国主要采用减毒疫苗和灭活疫苗进行防控,然而灭活疫苗虽具有一定的免疫保护效果,但是免疫期短,注射疫苗人工成本高。因此,迫切需要一种新型疫苗对羊支原体肺炎进行防控。羊痘病毒可插入26-45 kb
【基金项目】
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兵团区域创新引导项目“狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的优化及推广应用”的部分研究成果（项目编号:2021BB014）课题主持人:李有文教授（塔里木大学）；
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羊支原体性肺炎是由支原体引起的羊的呼吸系统疾病,主要的病原为丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种以及绵羊肺炎支原体,分别引起山羊的败血症、山羊传染性胸膜肺炎和绵羊支原体肺炎。对于羊支原体肺炎的防控,目前我国主要采用减毒疫苗和灭活疫苗进行防控,然而灭活疫苗虽具有一定的免疫保护效果,但是免疫期短,注射疫苗人工成本高。因此,迫切需要一种新型疫苗对羊支原体肺炎进行防控。羊痘病毒可插入26-45 kb的外源基因而不影响病毒繁殖传代,具有研发重组多价疫苗的潜质,且羊痘病毒弱毒疫苗免疫效果好,是羊产业中必须免疫接种的疫苗。本研究拟以羊痘病毒疫苗株为载体,重组羊肺炎支原体重要抗原基因构建重组多价疫苗,以期能够同时对羊痘和羊支原体肺炎具有免疫保护作用。第一,将合成的山羊支原体山羊肺炎亚种（登录号:WP＿024070888.1）M17基因构建了其原核表达载体,对该基因序列进行了遗传进化分析,并对所编码蛋白的结构预测,采用I PTG诱导法对M17基因进行了蛋白表达及鉴定。第二用PCR扩增M17基因,经NheⅠ、B ss HⅡ酶切后,将其插入已经构建好的羊痘病毒表达载体pGM-TK13-P11-MSC-loxp-gpt-VV7.5-VV7.5-GFP中,构建了M17-羊痘病毒多价重组质粒,将重组质粒用Lipofectamine 2000转染至已感染羊痘病毒疫苗株GTPV AV41的羊睾丸细胞,荧光显微镜观察并挑取带荧光的病毒,反复冻融后,采用10倍比稀释并接种羊睾丸原代细胞,再挑取带荧光的病毒,稀释纯化5轮。结果成功构建了M17的原核表达载体M17-pET42b,测序发现大小为927bp,经同源比对,山羊支原体MCCP 1601株M17基因序列与参考株Mccp-JCVI-Syn3B-PS C09-L2（登录号:CP069346.1）亲缘关系较近,均与山羊支原体肺炎亚种属在同一分支上,同源性高达94.8%-98.3%。用生物信息学技术对其蛋白结构进行预测,编码了309个氨基酸,发现二级结构和三级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主。SDS-PAGE鉴定表明M17蛋白大量表达于沉淀中,在34.2 KDa处条带清晰,Western blot结果证明M17蛋白与His标签确实进行了融合表达。成功构建的羊痘病毒多价表达载体pGM-TK13-P11-M17-loxp-gpt-VV7.5-VV7.5-GFP,转染细胞得到的重组病毒,经5轮筛选纯化获得一株重组山羊肺炎支原体抗原蛋白M17-羊痘疫苗病毒。为筛选出具备高度保守和免疫原性良好抗原并作为重组疫苗候选株,并为构建多价重组疫苗奠定了理论基础。第三,利用生物信息学技术和同源重组的方法来探究绵羊肺炎支原体抗原蛋白热休克HSP70/IFN-γ/TU基因的生物学功能,并对该基因序列进行同源性比对、蛋白结构预测分析,并合成三联基因,经NheⅠ、Bss HⅡ双酶切,将三联基因与已经构建好的羊痘病毒表达载体pGM-TK13-VV7.5-MSC-loxp-gpt-VV7.5-VV7.5-GFP相连接,构建了绵羊支原体三联基因-羊痘病毒多价重组质粒,将重组质粒用Lipofectamine 2000转染至已感染羊痘病毒疫苗株GTPV AV41羊睾丸细胞,荧光显微镜观察并挑取带荧光的病毒,反复冻融后,采用10倍比稀释并接种羊睾丸原代细胞,再挑取荧光病毒,继续稀释纯化。结果成功构建了绵羊支原体三联基因-羊痘病毒的表达载体pGM-TK13-VV7.5-HSP70/IFN-γ/TU-loxp-gpt-VV7.5-VV7.5-GFP,测序发现大小为2394 bp。经同源比对,绵羊肺炎支原体热休克蛋白HSP70与参考株绵羊肺炎支原体CVCC-384株在同一分支,但与参考株猪肺炎支原体7448株亲缘性相近,同源性高达97.6%-99.2%。用生物信息学技术对其蛋白结构进行预测,编码了310个氨基酸,发现二级结构和三级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主。成功构建了绵羊支原体三联基因-羊痘病毒表达载体,转染细胞得到的重组病毒,并对筛选得的重组病毒进行继续纯化。
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