研究背景我国现有2.9亿心血管疾病(CVD)患者,每5例死亡患者中就有2例死于心血管疾病。其中,缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)堪“头号杀手”,寻找有效的IHD防治措施是国家重大的医疗卫生需求。由于冠状动脉收缩、血管痉挛、血栓形成等原因造成心肌缺血可导致缺血性损伤(ischemic injury)。因此,尽早恢复心肌组织的血流灌注(即再灌注,reperfusion)是防治缺血性损伤的基本措施。但是,随着临床观察和实验研究的深入后发现,组织缺血后恢复灌注反而使缺血所致的功能和代谢障碍及结构破坏进一步被加重,此乃缺血-再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/R injury)。在心肌组织中,Jennings等人在1960年首次提出I/R损伤这个概念。此后,心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/R)的防治始终是临床救治IHD过程中亟待解决的重要问题。深入细致的分析MI/R损伤的分子基础和内在信号机制进而开展MI/R防治新策略也是实验研究的主要任务。采用外源性药物处理或者激活内源性物质防治MI/R损伤是目前两个主流的研究方向。为深入探讨MI/R损伤的分子基础和生物学机制,本研究采用小鼠心肌缺血再灌注模型,分别从在体心脏功能和离体心脏灌流实验探讨心肌缺血再灌注损伤的药物防治新方法并分析可能的机制。本课题进行了两部分的研究工作。第一部分 二甲双胍(metformin)抑制心肌缺血再灌注损伤的新机制:AMPKα1/2亚基协同调控心肌自噬自噬(autophagy)这种代谢途径广泛存在于真核细胞中。自噬可以通过溶酶体机制完成对自身变性的蛋白质以及受损细胞器的降解,并且在维持心肌稳态中发挥重要作用,主要作用为循环利用细胞内底物和能量以及清除心肌异常蛋白。大量研究发现,自噬功能异常在心血管疾病中发挥着重要作用。在急性心肌梗死中,心肌可通过自噬功能来降解蛋白及脂质实现供能;又可通过自噬清除破损细胞器(如线粒体)减轻细胞氧化应激负荷,从而抑制心肌细胞死亡。因此,探讨如何调控心肌自噬功能的潜在重要机制,以及心肌自噬水平对心肌缺血再灌注损伤的影响,是近年来的研究热点。我们的前期研究和相关报道均显示心肌缺血期和再灌注期均会严重影响自噬水平,但仍然存在争议。有观点认为,心肌在再灌注过程中会导致自噬过度激活并造成心肌细胞结构破坏,诱导细胞凋亡或坏死。但随着“自噬流(autophagy flux)”概念的提出,心肌中自噬相关蛋白水平升高也可能是自噬功能障碍导致的底物堆积。有必要对心肌缺血期和再灌注期心肌自噬水平进行分别探讨。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)作为重要的心肌“生存信号”,是心肌内最重要的促生存激酶之一。在心肌中,AMPK以异源三聚体形式存在,其中包括α,β,γ三种功能亚基。α亚基是催化亚基,包含具有激酶活性的磷酸化位点。α亚基又包括α1和α2两个亚单位,α1主要位于细胞质内,α2位于细胞核内在肝脏、心肌、骨骼肌等组织中表达较高。虽然激活AMPK所发挥的心肌保护作用和对心肌自噬的调控作用已被广泛报道。以往的报道并没有明确区分在心肌缺血再灌注过程中AMPKα1和AMPKα2对心肌自噬的调控是否具存在信号差异?近年来越来越多的研究显示,二甲双胍(metformin)作为治疗糖尿病的经典药物的同时还被发现具有多种生物学作用。实验研究发现,metformin可以减轻心肌缺血再灌注损伤;metformin可有效激活心肌AMPK;metformin可通过激活AMPK抑制m TOR信号促进自噬、减少氧化应激、提高细胞抵抗应激的能力。因此,metformin与心肌AMPK,心肌自噬和心肌保护作用密切相关,但相关机制仍在探讨。实验目的本研究旨在探讨:(1)在心肌缺血再灌注损伤中,AMPKα1和α2信号是否分别通过胞浆信号和核内信号调控自噬;(2)metformin能否协同调节细胞浆AMPKα1和细胞核中的AMPKα2改善自噬功能,抑制心肌缺血再灌注损伤。实验方法采用6-8月龄成年雄性C57BL/6小鼠,构建在体心肌缺血再灌注损伤模型。分别在缺血30分钟或缺血30分钟并再灌注2小时后收集缺血区心肌组织,采用蛋白质免疫印迹法检测相关蛋白表达水平,采用免疫共沉淀法确定蛋白质相互作用。按照实验方案采用metformin(125μg/kg,i.p.)腹腔注射处理四周后,建立心肌缺血再灌注损伤模型,观察心肌自噬水平和损伤程度。部分实验中采用6-8月龄C57背景的AMPKα2敲除小鼠(AMPKα2 KO)进行实验,以同龄野生型C57小鼠为对照,探讨AMPKα1和α2的生物学作用。实验结果1.心肌缺血再灌注导致心肌自噬流功能障碍。分别观察单纯缺血后和缺血再灌注后心肌自噬相关蛋白结果显示:与对照组相比,缺血心肌组中自噬体蛋白Atg5和LC3-II水平显著增加;溶酶体标志蛋白LAMP2出现降低;自噬底物标记蛋白p62水平则并未出现升高(P均<0.05)。上述结果提示,心肌缺血可导致自噬体增加,溶酶体消耗,抑制底物堆积,激活自噬流。但是,再灌注组心肌中Atg5,LC3-II,LAMP2水平较缺血组相比显著降低,p62水平却显著升高(P<0.05)。该结果提示,在再灌注后心肌自噬体和溶酶体生成障碍,底物显著堆积,表现为心肌自噬流受阻。并且发现,在再灌注心肌中自噬调控因子TFEB核转位受到抑制,更多的TFEB停留在胞浆中。2.分离各组心肌组织的细胞浆与细胞核组分,分别观察心肌AMPKα1和α2信号途径。结果显示:心肌缺血30分钟后,在胞浆中心肌AMPK磷酸化水平显著升高,其下游m TOR的磷酸化水平随之减退,提示缺血刺激激活心肌AMPK。在此过程中胞浆AMPKα1蛋白水平未发生明显变化。但是,在再灌注组心肌中,胞浆AMPKα1蛋白水平较缺血组显著降低,AMPK磷酸化水平迅速回落,下游m TOR的磷酸化水平随之回升。上述结果表面,再灌注期间心肌自噬功能障碍可能是由于心肌胞浆AMPKα1减退,削弱了AMPK活性,并通过m TOR信号抑制了心肌自噬。3.课题组前期研究证实:心肌CARM1是调控自噬相关蛋白表达的重要转录因子TFEB的共激活因子;激活心肌细胞核内AMPK可通过Fox O3a调控SKP2的表达水平,而SKP2作为E3泛素连接酶调控CARM1的稳定性。在本研究中进一步发现,在缺血期间,心肌细胞核内心肌AMPKα2保持较高水平,激活Fox O3a磷酸化抑制SKP2表达水平,从而促进心肌CARM1维持较高水平。免疫共沉淀结果也显示,缺血心肌中核内CARM1与TFEB相互作用显著增强(P均<0.05)。该结果与上述缺血心肌自噬增强一致。但是,在再灌注组心肌中,核内AMPKα2水平较缺血组出现降低,下游Fox O3a磷酸化水平随之减退,导致了SKP2表达水平显著上升(P均<0.05)。失去抑制的SKP2大量降解CARM1,导致再灌注心肌核内CARM1-TFEB相互作用显著削弱。该结果与上述再灌注心肌自噬功能障碍结果一致。4.本研究进一步对小鼠进行metformin处理4周(125μg/kg)建立MI/R模型,提取心肌核与浆组分分析发现,在细胞浆中,metformin处理可上调缺血心肌和再灌注心肌胞浆中AMPKα1水平,抑制再灌注心肌胞浆m TOR磷酸化,促进TFEB入核转位。另一方面,在核内,metformin处理有效改善了再灌注心肌核内AMPKα2水平,通过Fox O3a磷酸化抑制SKP2的表达,有效维持再灌注心肌核内CARM1水平。免疫共沉淀结果证实,metformin处理促进了TFEB的核转位,有效提高了心肌核内CARM1-TFEB相互作用(P均<0.05)。5.与对照组相比,metformin处理有效的提高了再灌注心肌Atg5,LC3II和LAMP2水平,有效减少p62水平,提示metformin处理激活了再灌注心肌自噬流。因此我们进一步采用m RFP-GFP-LC3荧光双染法检测心肌自噬流结果显示:metformin处理可有效促进再灌注心肌的自噬体与溶酶体相互融合,恢复自噬流。6.为了进一步明确AMPKα亚基在metformin对自噬调控中的作用,本研究在AMPKα2 KO小鼠中发现:AMPKα2敲除虽然不影响胞浆中AMPKα1在缺血和再灌注过程中的变化,但是削弱了AMPK磷酸化总体水平,胞浆m TOR磷酸化水平升高,抑制TFEB入核。在核中,AMPKα2的缺失导致再灌注心肌Fox O3a磷酸化被显著抑制,进而导致SKP2表达上调和CARM1水平降低。更为重要的是,AMPKα2 KO消除了metformin对再灌注心肌自噬流的促进作用,表现为Atg5、LC3II、LAMP2表达下降,且p62堆积。免疫荧光显示出自噬体与溶酶体融合障碍。这些结果表明,metformin依赖于AMPKα2调控再灌注心肌自噬流。7.与上述结果相对应,在整体实验中证实:与对照组相比,metformin处理可以有效抑制心肌缺血再灌注损伤,表现为metformin处理有效降低了心肌梗死面积;降低血浆乳酸脱氢酶(LDH)水平;有效提高缺血再灌注心脏左室射血分数。最终,metformin处理显著减少了遭受心肌缺血再灌注损伤小鼠的死亡率。结论本研究发现:1.心肌胞浆AMPKα1-m TOR信号调控TFEB入核,核内AMPKα2-Fox O3a-SKP2信号调控CARM1水平并与TFEB相互作用发挥自噬调控作用。2.再灌注心肌AMPKα1和α2均被显著削弱,导致再灌注心肌自噬功能障碍,自噬流受阻;3.metformin处理可分别通过上调细胞质中AMPKα1和细胞核中AMPKα2,改善再灌注心肌CARM1-TFEB相互作用,改善心肌自噬,最终抑制缺血再灌注心肌损伤。AMPKα1和α2协同激活调控心肌自噬流是metformin抑制心肌缺血再灌注损伤的新机制。由于动物实验研究周期较长,课题组正在构建诱导性心肌特异性AMPKα1/2敲除小鼠,将在后续研究中进一步细化和明确metformin通过AMPKα1/2信号实现自噬调控的差异和(或)协同机制。第二部分 褪黑素(melatonin)强化HTK液对缺血再灌注心肌的保护作用心脏外科手术需要使心脏停跳以便于进行手术矫治,此时心脏处于缺血状态,随着主动脉的阻断又开放不可避免心肌出现缺血再灌注损伤。如何抑制心脏缺血/再灌注损伤一直是心脏外科永恒的话题。对停搏期间心脏保存进行干预,延长心脏保存时间并促进再灌注后心脏功能恢复对于心脏外科手术意义重大。目前临床上常用的心脏保存灌注液为HTK液(histidine-tryptophan-ketoglutarate)、UW液(University of Wisconsin)和Celsior液三种。HTK是一种脏器保护液,含有组氨酸(histidine)、色氨酸(tryptophane)和酮戊二酸(ketoglutarate)三种成分,因此取其三种成分首字母称为HTK液。HTK液的基本成份是一种电解质混合液,所含钠、钾、钙与细胞内水平相仿,在心肌保护中,属于细胞内液型心脏停跳液,是最常用的心脏保存液之一。但是,HTK液对心肌I/R损伤的防护作用仍有待提升和改善。褪黑素(melatonin)是人类的松果体产生的一种胺类激素,被证实为一种强有力的抗氧化剂。melatonin对细胞结构的保护主要通过○1参与清除氧自由基○2抗氧化,降低过氧化物含量○3抑制脂质的过氧化反应。虽然melatonin已被认为具有心肌保护作用,但是添加melatonin能否提升HTK液对缺血再灌注心肌的保护作用?目前尚不得知。实验目的本研究旨在探讨:(1)melatonin能否提升HTK液心肌保护作用并抑制缺血再灌注损伤;(2)分析上述作用的相关信号机制。实验方法本研究采用3-4月龄成年C57小鼠建立离体心脏灌流系统,随机分为四个实验组(正常对照组;缺血再灌注组;HTK停搏再灌注组;HTK-melatonin停搏再灌注组)。定量检测各组心脏功能,再灌注结束后提取心肌组织检测相关心肌损伤标志物和信号蛋白表达情况。实验结果1.与正常对照组相比,缺血再灌注导致心功能严重受损。采用HTK液停搏后再灌注可部分减轻心脏损伤。进而,在HTK停搏液中加入不同浓度的melatonin(30-60μmol/L)后观察心脏保护效果,发现melatonin可进一步提升心肌保护效果:与单纯HTK组相比,提高再灌注后LVDP,收缩舒张速率,显著减少灌流液中c Tn1和LDH的释放。并且发现50μmol/L melatonin改善离体灌流心脏心率收缩压乘积效果最佳,后续实验随即采用50μmol/L浓度的melatonin进行。2.再灌注结束后用TTC进行染色观察心肌梗死情况,结果显示:缺血再灌注组出现明显的心肌梗死。与缺血再灌注组相比,HTK组小鼠心肌梗死面积有所减小。添加melatonin可进一步减小心肌梗死面积,提高心肌保护作用。3.对各组心肌细胞能量代谢及线粒体状态进行检测,结果显示:与对照组相比,缺血再灌注组小鼠的ATP合成酶活性以及柠檬酸盐合成酶活性均显著降低;HTK组心肌ATP合成酶活性以及柠檬酸盐合成酶活性有所提高。melatonin可增强HTK的保护作用。透射电子显微镜结果与此一致,与缺血再灌注组相比,HTK组心肌线粒体损伤减轻,并且添加melatonin可进一步缓解线粒体损伤程度。4.在本研究的实验方案中,我们发现HTK液并不能改善缺血再灌注心肌的内质网应激(ER stress)。检测ER stress的相关蛋白的表达结果显示:缺血再灌注组心肌p-PERK、p-e IF2α、CHOP、ATF4表达量明显上调,HTK组心肌ER stress程度没有得到改善。但是,添加melatonin却可明显抑制ER stress程度发挥心肌保护作用。5.检测各组心肌脂质过氧化和羰基应激程度发现:HTK组可降低缺血再灌注后心肌4-HNE和MDA含量,降低心肌蛋白质羰基化程度,提升心肌ALDH2活性水平。添加melatonin进一步增强上述保护作用,有效抑制心肌羰基应激。6.检测各组心肌AMPK磷酸化激活程度发现:HTK组可有效升高缺血再灌注心肌AMPK磷酸化,并且melatonin可以进一步上调心肌缺血再灌注时心肌AMPK磷酸化。用AMPKα2 KO小鼠进行平行实验发现,HTK组和HTK+melatonin组均不能改善缺血再灌注后心脏功能和减少心肌损伤,心肌保护作用消失。结论本研究明确显示melatonin可增强HTK液对离体停跳复灌心脏的保护作用,减轻线粒体损伤并改善能量代谢,改善收缩舒张功能,抑制心肌损伤,减小梗死面积。我们的研究结果还提示新的线索:HTK液并不能缓解缺血再灌注心肌的ER stress,但是添加melatonin后可有效抑制ER stress;melatonin可强化对心肌羰基应激的防护作用;melatonin增强HTK心肌保护作用与心肌AMPK密切相关。上述发现为melatonin强化HTK心肌保护作用提供了可能的机制解释,将为发展围手术期离体心脏保护策略提供新的实验依据。目前课题组正在通过对各处理组心肌蛋白质组学分析,将在后续实验中深入探讨melatonin处理对停搏离体心脏再灌注后所发挥的心肌保护作用的内在分子网络机制。