前言　　退变性椎间盘疾病(DegenerativeDiscDisease，DDD)是由椎间盘退变(IntervertebralDiscDegeneration，IDD)引起的以颈肩腰腿疼痛为主要表现的临床症候群，包括腰间盘突出症、腰椎管狭窄症、颈椎病、椎间盘源性腰痛、颈腰椎不稳症等，是导致人群劳动能力丧失或下降的主要原因，对社会经济产生严重的影响。IDD是DDD的前提和病理基础，由于椎间盘组织再生能力有限，一旦发生退变，很难阻止或逆转。目前对DDD的治疗主要包括应用非甾体类抗炎药物控制炎症反应的保守治疗和脊柱融合或脊柱关节成型等手术治疗，二者均只能有限的缓解椎间盘退变所引起的临床症状，没有对退变椎间盘的组织结构进行修复，更不能从根本上延缓或逆转椎间盘退变过程。尽管IDD确切的病因、病理生理过程仍然不十分明确，但最终共同的表现均为髓核细胞数量减少，生物活性下降以及细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)含量的进行性减少，IDD的核心是椎间盘组织合成代谢和分解代谢之间的不平衡所引起的。　　既往的研究表明:髓核组织中的Ⅱ型胶原和蛋白多糖是构成椎间盘ECM的主要成分，其含量的下降直接影响椎间盘的生物学功能。尝试利用现代基因治疗技术将能够增强髓核细胞生物活性或能够增加椎间盘ECM合成与抑制ECM降解的外源基因通过载体导入靶细胞，使目的基因在靶细胞内表达并产生对机体有利的蛋白质，增加椎间盘ECM的含量，可以达到减缓或逆转IDD，改善椎间盘结构，维持其正常生理功能的目的。目的基因，载体和靶细胞选择是基因治疗中的三个关键因素;目前研究表明:干预椎间盘退变具有治疗潜力的候选基因大致分为两类:一类是促进ECM合成的基因:包括转化生长因子(TGF-β1)、骨形态发生蛋白（BMP-2，7）、胰岛素样生长因子(IGF-1)、Sox9等。另一类是促进ECM降解的基因，包括白介素(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、基质金属蛋白酶(MMPs)等。其中，基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)是椎间盘组织中重要的基质降解酶之一，通过被激活后过度降解ECM参与椎间盘的退变。有研究显示MMPs与内源性金属蛋白酶组织抑制剂(Tissueinhibitorofmetalloproteinases，TIMPs)之间的平衡失调是导致IDD的重要原因。通过尝试抑制分解代谢的途径增加ECM含量在IDD的基因治疗中是一种新的思路，TIMPs逐渐成为治疗IDD热门的候选基因。目的基因成功导入靶细胞需要应用载体的辅助，因此选择安全高效的转基因载体是基因治疗中的关键因素。病毒载体具有转染效率高的特点，特别是腺病毒载体能够有效的转染非分裂期静止的细胞，对于转染椎间盘细胞具有一定的优势，被认为是比较理想的载体。理想的靶细胞当然是椎间盘同源细胞，但椎间盘组织内的低细胞密度可能妨碍足够数量细胞被转染，限制目的基因表达产物的产量，降低生物学效应;退变椎间盘组织获取髓核细胞非常困难，而且髓核细胞分离、培养难度很大。近年来，许多试验探索骨髓间充干细胞(BoneMesenchymalStemCell，BMSC)作为靶细胞治疗IDD，取得了令人鼓舞的效果。BMSCs具有高度的可塑性和多向分化能力，容易获取且相对容易掌控，在活体内具有很高扩张能力;更为重要的是BMSCs可以感受组织损伤后微环境的变化，在适当的微环境中可以分化出类髓核细胞。因此，BMSCs不仅可以作为单独的细胞移植发挥其对退变椎间盘的修复作用，而且可以作为基因治疗中的靶细胞，为目的基因表达蛋白产物提供场所，是IDD基因治疗中理想的靶细胞。　　IDD是一个多因素参与的复杂过程，遗传学机制尚不明确。目前开展基因治疗的基础性研究还十分有限，最终从实验室走向临床还面临诸多困难。本课题针对目前该领域内的一些前沿问题，进行科学合理的实验设计，通过体外将携带金属蛋白酶组织抑制剂-1(hTIMP-1)cDNA的腺病毒载体转染BMSCs，通过转基因BMSCs移植的方式注入兔退变椎间盘髓核中，对目的基因表达情况以及目的基因表达产物对椎间盘组织ECM的作用效果进行分析，用以评价其对兔退变椎间盘ECM的影响，探索IDD最佳的基因治疗方式，为提高基因治疗IDD的疗效提供理论依据。　　实验方法　　实验一:基质金属蛋白酶组织抑制剂1基因重组腺病毒载体的构建:以含hTIMP-1cDNA序列的质粒为模板，通过PCR方法扩增hTIMP-1cDNA片段，将hTIMP-1cDNA全长定向克隆到AdMaxTM腺病毒系统穿梭质粒pDC316上，构建pDC316-hTIMP-1穿梭质粒，并通过PCR与酶切方法鉴定构建正确;利用AdMaxTM腺病毒包装系统和脂质体介导的转染技术，穿梭质粒pDC316-hTIMP-1及骨架质粒pBHGlox_E1，3Cre共同转染HEK293细胞，同源重组构建含hTIMP-1cDNA的重组腺病毒载体Ad-hTIMP-1，通过PCR方法鉴定重组腺病毒载体Ad-hTIMP-1的正确性;使用阴离子柱层析方法纯化重组腺病毒载体Ad-hTIMP-1并使用TCID50法测定Ad-hTIMP-1感染性滴度。　　实验二:重组腺病毒载体Ad-hTIMP-1转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究:采用梯度离心法体外分离并培养兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)，通过流式细胞仪检测细胞表面抗原CD45，CD34，CD44及CD90的表达，鉴定BMSCs的正确性;使用携带绿色荧光蛋白的腺病毒载体质粒pYr-adshuttle-4体外转染BMSCs，荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，确定最佳感染复数值(MultiplicityOfInfection，MOI);按照最佳MOI值转染BMSCs，设立重组腺病毒载体Ad-hTIMP-1转染BMSCs为hTIMP-1组，腺病毒载体质粒pYr-adshuttle-4转染BMSCs为阴性对照组，BMSCs为空白对照组;荧光定量PCR，Western-blot及免疫细胞化学等方法检测hTIMP-1在BMSCs中的表达。　　实验三:Ad-hTIMP-1转染BMSCs移植对兔退变椎间盘细胞外基质的影响:采用纤维环穿刺法手术建立兔L3/4，L4/5，L5/6椎间盘退变模型;在模型制作过程中，随机分为单纯BMSCs移植组，转基因BMSCs移植组和对照组，使用微量注射的方法分别向椎间盘髓核组织中注射单纯BMSCs悬液，Ad-hTIMP-1转基因BMSCs悬液和PBS液;术后12周通过影像学检查，手术取材后通过大体标本与病理学检查评估椎间盘退变程度;使用紫外分光光度法和免疫组化方法测定椎间盘髓核组织ECM，即Ⅱ型胶原与蛋白多糖的含量，评价转基因BMSCs移植对退变椎间盘髓核组织ECM含量的影响;通过荧光定量PCR，western-blot及免疫组化方法检测椎间盘髓核组织hTIMP-1在mRNA和蛋白水平的表达。采用SPSS17.0软件进行统计学分析，数据以X±S形式表达，采用单因素方差分析，独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。　　实验一:基质金属蛋白酶组织抑制剂1基因重组腺病毒载体的构建:以pMD-hTIMP-1质粒为模板的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在630bp左右可见到DNA条带，与预计长度一致，说明成功扩增出目的hTIMP-1cDNA片段;重组穿梭质粒pDC316-hTIMP-1为模板进行PCR，获得PCR扩增产物;重组穿梭质粒pDC316-hTIMP-1经EcoRⅠ和SaⅡ双酶切;将扩增产物与酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，结果在3.9kb和630bp左右可见到DNA条带;与预计长度一致，说明成功将目的基因hTIMP-1克隆到穿梭质粒pDC316载体质粒上;运用脂质体转染技术，双质粒共转染HEK293细胞，完成同源重组，产生重组腺病毒Ad-hTIMP-1;以Ad-hTIMP-1病毒液为模板进行PCR，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在630bp左右出现DNA条带，与预计长度一致，说明成功构建重组腺病毒Ad-hTIMP-1;半数组织培养感染剂量法(TCID50)测定重组腺病毒Ad-hTIMP-1的感染性滴度为1×1010IU/ml。　　实验二:Ad-hTIMP-1重组腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究:梯度离心法成功分离兔BMSCs，流式细胞仪检测CD44及CD90阳性细胞比例为95.61％及96.53％，CD34及CD45阳性细胞比例为0.76％及12.77％，符合BMSCs细胞表型;以携带绿色荧光蛋白的腺病毒载体质粒pYr-adshuttle-4(滴度为1×1010pfu/ml)转染BMSCs后24h镜下观察绿色荧光:MOI为1000时镜下90％细胞内可见绿色荧光，细胞形态良好，转染效率达90％;荧光定量PCR及Western-Blot结果显示:与阴性对照组和空白对照组相比，hTIMP-1组中hTIMP-1在mRNA水平（hTIMP-1组239.3746±19.5800，空白对照组1.0037±0.1044，阴性对照组1.0038±0.1079）以及蛋白水平（hTIMP-1组0.41，空白对照组0.02，阴性对照组0.09）均有明显表达，差异具有显著性(P＜0.05);免疫组化结果显示，hTIMP-1组BMSCs胞浆中充满棕黄色颗粒，而阴性对照组与空白对照组BMSCs胞浆中未见棕黄色颗粒，证实hTIMP-1蛋白在BMSCs胞浆中的有效表达。　　实验三:Ad-hTIMP-1转染BMSCs移植对兔退变椎间盘细胞外基质的影响:通过大体观察及病理学检查证实纤维环穿刺法成功建立兔椎间盘退变模型;相对于对照组，转基因BMSCs移植组与单纯BMSCs移植组椎间盘退变程度减轻;放射线检查提示:与转基因BMSCs移植组(0.896±0.039)及BMSCs移植组（0.842±0.0428）相比，对照组（0.791±0.036）椎间隙相对高度减少更加明显，差异具有显著性（P＜0.05）;分光光度法及免疫组化证实:与转基因BMSCs移植组（0.896±0.039，0.354±0.022）以及BMSCs移植组（0.842±0.0428，0.272±0.014）相比，对照组(0.791±0.036，0.218±0.013)髓核组织内细胞外基质即蛋白多糖与Ⅱ型胶原含量减少更加明显，差异具有显著性(P＜0.05);BMSCs移植组与转基因BMSCs移植组相比，蛋白多糖与Ⅱ型胶原含量明显减少，差异具有显著性（P＜0.05）;荧光定量PCR，Western-blot以及免疫组化结果证实:转基因BMSCs移植组髓核中hTIMP-1在mRNA和蛋白水平均有明显表达（P＜0.05）。　　结论　　成功构建含有基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(hTIMP-1)cDNA的重组腺病毒载体(Ad-hTIMP-1)，病毒感染性滴度为1×1010IU/ml。携带有hTIMP-1cDNA的重组腺病毒载体（Ad-hTIMP-1）可以高效转染兔BMSCs并能够稳定表达hTIMP-1外源基因。腺病毒介导hTIMP-1转基因BMSCs移植以及单纯BMSCs移植兔退变椎间盘，均可以有效减轻椎间盘退变程度，增加细胞外基质含量;腺病毒介导hTIMP-1转基因BMSCs移植兔退变椎间盘，通过外源hTIMP1基因的有效表达，抑制细胞外基质降解以及BMSCs移植促进细胞外基质合成的双重作用，能够更加有效的增加细胞外基质:即蛋白多糖与Ⅱ型胶原的含量，效果优于单纯BMSCs移植。因此，以转基因技术与细胞移植技术相结合的方式干预IDD能够更加有效的减轻IDD程度，延缓IDD进程，提高基因治疗IDD的疗效。