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研究背景与目的:食管癌（Esophageal cancer,EC）是国内外最常见的消化道恶性肿瘤之一,具有发病率高,预后差等特征。每年中国的食管癌患病人数约占全球总病例数的一半,为国家带来了严重的疾病负担。食管癌的发生是一个多因素长时间作用的过程,影响因素主要包括环境因素、饮食习惯和遗传因素等。但近年来随着研究的深入,越来越多的研究表明:微生物菌群在食管癌的发生、发展中起着不容忽视的作用。然而目前大多数关于食管癌与微生物的研究都主要集中在口腔或食管局部的微生物分析上,关于肠道中微生物与食管癌发生发展的关系目前所知甚少。因此,本研究应用16s r RNA基因测序技术,识别食管癌患者肠道微生物谱的特征,比较食管癌患者与健康人群的菌群差异,探讨细菌内毒素对食管癌细胞生物学功能的影响并初步探索其影响食管癌细胞侵袭和迁移的机制,为进一步了解食管癌发生发展与肠道微生物之间的内在关联,寻找食管癌诊断和治疗的新靶点提供合理的数据参考和研究支持。研究方法:1.收集江苏省淮安市经食管癌诊断标准首次确诊为食管癌的患者23例,将年龄和性别作为匹配因素,1:1配对纳入符合入选条件的健康人群23例,分别收集癌症患者与健康人群的粪便和血液样品,应用粪便微生物DNA提取试剂盒提取微生物DNA,并对16S rDNA V4区进行特异性扩增,在Illumina-Hi Seq高通量测序平台上完成测序工作后,对测序结果进行整理分析,比较两组肠道微生物在组成和结构上的差异,并分析在食管癌患者和健康人群肠道中相对丰度有显著差异的菌群。2.根据测序结果选取组间有代表性的差异菌属,依据其16S rDNA基因序列合成相应的引物,应用实时荧光定量PCR技术对46例研究对象进行菌属的绝对定量分析,更全面地分析两组间菌群的丰度差异。并收集100例食管癌患者,50例健康人群的粪便样本提取DNA,再次进行实时荧光定量PCR反应,验证上述菌属的绝对丰度值。3.应用ELISA实验检测食管癌患者和健康对照人群血清中细菌内毒素水平的差异,并应用q RT-PCR检测其受体TLR4在食管癌组织和癌旁组织中表达水平的差异。4.通过CCK8实验,观察细菌内毒素对食管癌细胞增殖的影响,并通过Transwell实验观察细菌内毒素对食管癌细胞侵袭和迁移能力的影响。5.通过Western Blot实验检测TLR4/NF-κB信号通路中关键蛋白的表达情况,并分别使用TLR4特异性通路抑制剂TAK242和NF-κB特异性通路抑制剂PDTC处理食管癌细胞后,比较食管癌细胞侵袭和迁移能力的变化。6.应用ELISA实验比较在有无TLR4特异性通路抑制剂TAK242和NF-κB特异性通路抑制剂PDTC处理的情况下,细菌内毒素作用食管癌细胞后IL-6和TGF-β1的水平差异。7.通过Western Blot实验检测EMT通路中关键蛋白E-cadherin蛋白,N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表达水平的差异。研究结果:一、食管癌患者肠道微生物谱的识别1.食管癌患者与健康对照人群肠道微生物α多样性分析（1）研究结果显示,食管癌患者的年龄、吸烟率、饮酒率和饮食习惯与健康对照组无显著性差异（p>0.05）。（2）46例样本一共获得1831个OTU,平均每个样本OTU数目为392个,其中两组共有OTU数目为609个,食管癌组特有的OTU数目为878个,健康对照组特有OTU数目为304个,稀释曲线显示样本测序深度已基本覆盖,测序数据可靠。（3）通过比较α多样性指数发现,食管癌组的Ace和Chao1指数高于健康对照组（p<0.05）。然而,Shannon指数和Simpson指数在食管癌组和健康对照组之间没有显著差异（p>0.05）。表明与健康对照人群相比,食管癌患者的肠道微生物物种丰富度显著增加,而均匀度没有明显改变。2.食管癌患者与健康对照人群肠道微生物β多样性分析（1）根据PCo A分析和UPGMA聚类树分析结果可知,同一分组之间的样本明显聚集,不同分组之间的样本明显分散,说明食管癌患者的微生物物种组成与健康对照人群明显不同。（2）Anosim分析结果发现,食管癌组和对照组组间差距大于组内差距（p<0.05）。表明食管癌患者肠道微生物群落结构与健康对照人群肠道微生物群落结构明显不同。（3）LEf Se分析结果表明,在属水平上,与健康对照组相比,食管癌组相对丰度显著增加的菌属分别是克雷伯菌属,疣微菌属,肠杆菌属,双歧杆菌属和链球菌属;相对丰度显著降低的菌属分别是毛螺菌属,拟杆菌属和Lachnoclostridium属。3.食管癌患者与健康对照人群肠道菌群差异分析（1）在菌门水平上,食管癌组共检出19个菌门,健康对照组共检出23个菌门。食管癌组中相对丰度排名大于1%的菌门分别是厚壁菌门,变形菌门,拟杆菌门,放线菌门和疣微菌门,健康对照组中相对丰度大于1%的菌门分别是拟杆菌门,厚壁菌门和变形菌门。Welch’s t检验表明,与健康对照组相比,食管癌组中的厚壁菌门（57.1%VS38.73%）和放线菌门（8.5%VS 0.12%）的相对丰度显著增加,但拟杆菌门（11.28%VS49.02%）的相对丰度却显著降低（p<0.05）。（2）在菌属水平上,食管癌组中共鉴定出197个菌属,健康对照组中共鉴定出235个菌属。食管癌组相对丰度大于1%的菌属分别是克雷伯菌属,拟杆菌属,链球菌属,双歧杆菌属,Subdoligranu Lum菌属,Faecalibacterium菌属和Agathobacter菌属。健康对照组中相对丰度大于1%的菌属分别是拟杆菌属,毛螺菌属,克雷伯菌属,Agathobacter菌属,Faecalibacterium菌属和Subdoligranu Lum菌属。经统计学检验发现,食管癌组与健康对照组相比,菌属相对丰度有差异且有统计学意义的有18个,其中相对丰度增加的有9个,分别是链球菌属,双歧杆菌属,Subdoligranu Lum菌属,劳特氏菌属,Romboutsia菌属,柯林斯菌属,Paeniclostridium菌属,Dorea菌属和奇异菌属。相对丰度减少的也有9个,分别是毛螺菌属,拟杆菌属,罗斯氏菌属,Lachnoclostridium菌属,副杆菌属,普雷沃菌属,产丁酸菌属,Tyzzerella菌属和萨特氏菌属。（3）经差异菌属贡献度分析发现,对两组间差异贡献最大的前三位菌属依次为拟杆菌属,克雷伯菌属,链球菌属。二、食管癌患者与健康对照人群肠道差异菌属的定量研究1.对23对样本进行实时荧光定量PCR检测,实验结果表明,与对照组相比,拟杆菌属（3.85E+09 VS 9.06E+10）,Lachnoclostridium菌属（1.59E+08 VS 2.61E+09）,毛螺菌属（4.96E+07 VS 3.08E+08）的绝对丰度在食管癌患者中均显著减少;双歧杆菌属（6.27E+08 VS 4.21E+07）,链球菌属（1.50E+09 VS 3.39E+08）的绝对丰度明显增多,而肠球菌属（1.83E+07 VS 9.61E+06）和克雷伯菌属（7.91E+09 VS 1.78E+09）的绝对丰度在两组人群中无明显差别。2.对100例食管癌患者和50例健康人群的样本进行实时荧光定量PCR检测进一步验证发现,总体趋势与23对样本的结果大体相同,与健康对照人群相比,食管癌患者肠道内拟杆菌属（1.00E+09 VS 1.14E+10）,Lachnoclostridium菌属（1.21E+07 VS1.76E+08）,毛螺菌属（6.42E+06 VS 8.10E+07）的绝对丰度均出现明显减少,双歧杆菌属（1.08E+09 VS 2.93E+08）,链球菌属（1.17E+08 VS 1.62E+07）,肠球菌属（1.17E+07VS 3.61E+06）和克雷伯菌属（1.60E+09 VS 2.87E+08）的绝对丰度则明显增加,差异均具有统计学意义（p<0.05）。根据两次实验结果可知,对食管癌患者与健康对照人群的肠道菌群定量结果可靠,具有代表性。三、细菌内毒素对食管癌细胞生物学功能的影响1.通过分析食管癌患者与健康对照人群血清样本中的脂多糖水平发现,食管癌患者血清中脂多糖的水平显著高于健康人群血清中脂多糖的水平（p<0.05）,其水平是健康对照人群的1.61倍（748 ng/L VS 464 ng/L）。表明食管癌患者日常可能暴露于更高水平的内毒素。2.应用RT-q PCR比较食管癌组织和癌旁组织中脂多糖受体TLR4 m RNA的表达水平,结果发现在食管癌组织中,TLR4 m RNA的表达水平相较于癌旁组织而言明显提高（相对表达量为2.164倍,p<0.05）。表明TLR4在食管癌组织中的特异性高表达。3.将食管癌细胞EC109用不同浓度的脂多糖（0,500ng/m L,1μg/m L,5μg/m L,10μg/m L）处理后,分别培养24h,48h,72h,通过CCK-8法检测其增殖能力。结果发现:随着染毒时间和染毒剂量的增加,食管癌细胞增殖能力增强（最低剂量组细胞相对增值率约为1.1倍,最高剂量组约为1.3倍）,差异具有统计学意义（p<0.05）。这表明脂多糖可以促进食管癌细胞增殖,但生理学意义有限。4.为研究脂多糖对食管癌细胞侵袭和迁移的影响,我们用不同浓度的脂多糖（0,500ng/m L,1μg/m L,5μg/m L,10μg/m L）处理食管癌细胞EC109,并分别检测食管癌细胞的侵袭和迁移能力。实验结果显示:与对照组相比,脂多糖处理能显著增加食管癌细胞侵袭和迁移的数目（p<0.05）,且呈现出剂量依赖性（最低剂量组细胞穿膜数约为对照组穿膜数的1.5倍,最高剂量组约为3倍）,脂多糖浓度越高,则细胞穿膜数目越多。这表明脂多糖能显著促进食管癌细胞EC109的侵袭和迁移能力。四、细菌内毒素促进食管癌细胞侵袭迁移的机制探讨1.为探讨TLR4/NF-κB信号通路是否可以被脂多糖特异性激活,我们选用了不同浓度梯度的脂多糖（0,500ng/m L,1μg/m L,5μg/m L,10μg/m L）刺激食管癌细胞,观察相关蛋白的表达情况,结果发现,随着脂多糖浓度的增加,TLR4蛋白和NF-κB p65蛋白的表达量呈现出剂量依赖性增加（p<0.05）。2.为探讨脂多糖对食管癌细胞的促侵袭和迁移作用是否与TLR4/NF-κB信号通路有关,我们分别用TLR4信号通路抑制剂TAK242和NF-κB信号通路抑制剂PDTC对细胞进行处理后,再观察脂多糖对食管癌细胞侵袭迁移能力的影响,结果发现,用TAK242或PDTC处理食管癌细胞后,脂多糖对食管癌细胞的促侵袭和促迁移作用被消除（p<0.05）。3.为探讨TLR4/NF-κB信号通路对食管癌细胞分泌IL-6和TGF-β1的影响,我们分别用TLR4信号通路抑制剂TAK242和NF-κB信号通路抑制剂PDTC处理细胞,比较食管癌细胞培养上清液中IL-6和TGF-β1水平的差异。结果发现,与空白对照组相比,脂多糖处理组中细胞培养上清中IL-6和TGF-β1的水平明显增加,而加入抑制剂处理后,细胞培养上清中IL-6和TGF-β1的水平明显则显著下降（p<0.05）。这表明脂多糖可通过TLR4/NF-κB信号通路影响食管癌细胞分泌IL-6和TGF-β1。4.为验证IL-6和TGF-β1是否是通过EMT信号通路发挥对食管癌细胞的生物学效应,我们进一步检测了EMT信号通路相关蛋白的表达情况。结果显示:与空白对照组相比,脂多糖处理组E-cadherin蛋白表达水平明显下调,N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表达水平明显上调（p<0.05）;而抑制剂处理组E-cadherin蛋白表达水平明显上调,N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表达水平明显下调（p<0.05）。这表明脂多糖可能是通过激活TLR4/NF-κB信号通路促进食管癌细胞IL-6和TGF-β1的分泌影响食管癌细胞的EMT进程,促进食管癌细胞的侵袭迁移。研究结论:1.与健康人群相比,食管癌患者体内肠道菌群明显失调,两组间肠道微生物组成明显不同,其菌群丰富度显著增加,而在多样性方面差异无统计学意义,差异菌属分析发现食管癌患者与健康人群肠道菌群相对丰度有差异的菌属共有18个,其中相对丰度升高和降低的菌属分别有9个。2.食管癌患者肠道内链球菌属,肠球菌属,克雷伯菌属,双歧杆菌属的绝对丰度明显升高,毛螺菌属,拟杆菌属,Lachnoclostrium菌属的绝对丰度明显降低。3.细菌内毒素在食管癌患者血清中的水平更高,其特异性受体TLR4在癌组织中特异性高表达,细胞实验表明,细菌内毒素可以促进食管癌细胞的增殖,侵袭和迁移。4.细菌内毒素可以通过激活TLR4/NF-κB信号通路,诱导IL-6,TGF-β1的分泌进而促进食管癌细胞的EMT进程,影响食管癌细胞的侵袭和迁移。