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目的和意义：推断死亡时间(Postmortem Interval,PMI)一直是法庭证据科学与法医实践中重要的历史性难题。本实验在前研究基础上，探讨死后肾组织自容腐败降解产生的游离氨基酸的提取，色谱法检测游离氨基酸的含量，研究含量与PMI的相关性，及其推断PMI的可行性。 材料与方法：屠宰场放血处死的健康成年家猪双肾组织，置于20℃、25℃、30℃恒温及75％恒湿的人工智能气候箱中，按0h-120h间每隔12h时间点取材，8个样本/时间点。 简化既往的萃取方法中，盐酸酸化、残渣二次酸化提取，设置处理方案分四组：酒精固定-萃取液不酸化萃取组、酒精固定-萃取液一次酸化萃取组、弃酒精固定-萃取液取残渣酸化萃取组、酒精固定-萃取液酸化残渣萃取组。 气相色谱质谱仪(安捷伦GC-MS，美国)检测：取0.1g肾皮质组织，80%乙醇溶液1:10固定72h，匀浆，5000r/min离心0.5h，取上清液400μL，乙腈去蛋白，取上清50μL，加20μL内标正亮氨酸，混匀吹干；加50μL的MTBSFA和50μL吡啶，微波炉中火衍生化2分钟；静置1h，取1μL进样，GC/MS检测，利用仪器配套数据分析工作站定性定量分析，标记各氨基酸及其峰面积，各氨基酸峰面积除以内标峰面积计算氨基酸相对含量。 统计分析 采用Simca-P13.0进行统计分析，包括主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、偏最小二乘法(Partial Least Square,PLS)，观察全部变化趋势及代谢轮廓。采用SPSS进行单因素方差分析、Bonferroni法两两比较均值、线性回归(Linear Regression,LR)、逐步多元线性回归(Stepwise Multiple Linear Regression,SMLR)，P<0.05为显著性差异。用GraphPad Prism5统计作图软件制图。 结果： 1、简化了二次盐酸酸化的酒精固定-萃取液不酸化萃取组，检测的各类氨基酸含量，除谷氨酸外，丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸等均明显高，P<0.05。但是，酒精固定-萃取液一次酸化萃取组，检测的谷氨酸含量明显高，优于其他萃取方法；四组萃取法检测的脯氨酸含量变化不明显，P=0.127。 2、GC-MS检测80%乙醇固定猪肾组织，各温度组氨基酸含量随PMI呈整体增加趋势： ⑴20℃组氨基酸含量与PMI的PCA：模型R2=0.764，Q2=0.55，所测的全部氨基酸在36h-60h之间较集中，与PMI呈明显线性增高趋势，0h-36h呈前“平台期”，84h后呈“波动性”，推断PMI的线性关系“窗口期”为36h-60h，提示20℃环境温度下，肾组织最佳推断PMI为死后60h之内。0h-120h之间线性拟合较高的氨基酸基回归方程分别为：此处为图表省略... 多元线性逐步回归分析方程为Y=15.519X丙氨酸+59.777X异亮氨酸+106.419X丝氨酸-2.111(R2=0.922，P<0.001，SE=14.737)。 ⑵25℃组氨基酸含量与PMI的PCA：R2=0.786，Q2=0.575，各氨基酸在36h-60h之间较集中，可较好的分离，与PMI呈明显线性增高趋势，0-36h呈前“平台期”，84h后呈“波动性”，的“窗口期”为36-72h，提示25℃环境温度下肾组织最佳推断PMI为死后36-60h之内。0-120h内线性拟合较高的氨基酸回归方程分别为：此处为图表省略... 多元线性逐步回归分析方程为Y=38.816X异亮氨酸＋138.192X丝氨酸＋50.846X赖氨酸＋1.912( R2=0.939，P<0.001，SE=12.274)。 ⑶30℃组氨基酸含量与PMI的PCA：R2=0.8，Q2=0.593，各氨基酸在24h-60h之间较集中，可以较好的分离，与PMI呈明显线性增高趋势0-24h呈前“平台期”，84h后呈“波动性”，的“窗口期”为24h-60h，提示30℃环境温度下肾组织最佳推断PMI为死后24-60h之内。0h-120h内线性拟合较高的氨基酸基回归方程分别为：此处为图表省略... 多元线性逐步回归分析方程为Y=38.816X异亮氨酸＋138.192X丝氨酸＋50.846X赖氨酸＋1.912( R2=0.939，P<0.001，SE=11.400) ⑷综合比较，随温度增高，同一时间点的氨基酸相对含量也随之高，提示三个温度组亦随温度增高而增高，按各温度组120h氨基酸含量-0h氨基酸含量的最高值与最低值之差，分别代表各组的蛋白质降解生成氨基酸速率V20℃、V25℃、V30℃，V25℃/ V20℃≈1.58～1.75:1、V30℃/V25℃≈1.49～1.68，即在环境温度相差10℃(30℃-20℃)时氨基酸生成速率约变化约2.35～2.94倍左右。 结论： 1、固定萃取液不需要酸化处理，不需要对残渣进行二提取，可缩短提取时间，减少人力物力和操作步骤，提高样品浓度，降低系统误差。 2、GC-MS检测80%酒精固定死后不同时间的肾组织，氨基酸相对含量时序性变化，可作为推断PMI的新方法，其最佳线性“窗口期”为死后36-72h，预测误差10h左右。 3、温度作为影响推断PMI的重要因素，环境温度明显加快肾组织蛋白质降解产生氨基酸的速率，30℃时约为20℃2.35～2.94倍左右，符合范特霍夫的温度与化学反应速率关系规则，可望作为温度矫正系数，克服温度对于推断PMI影响的瓶颈。 综上，基于不可避免的尸体器官组织自溶腐败剧烈地单向性降解蛋白质等生物大分子产生小分子结构性物质，存在一定的时序性降解代谢组学规律，具有很好地推断PMI应用前景。