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猪瘟（classical swine fever,CSF）是一种以高热稽留和广泛性出血为主要特征的猪的高度传染性疾病,对我国乃至全球多个国家的养猪业造成巨大的经济损失。目前,我国主要采取免疫接种猪瘟兔化弱毒疫苗株（C株或HCLV株）的措施来预防猪瘟。C株是一株集良好的安全性和免疫原性于一身的弱毒疫苗株,在全球猪瘟的防控中发挥了重要作用。但是,现阶段还没有商品化的标记C株疫苗可用,这使得在临床上区分野毒感染与疫苗接种（differentiation between infected and vaccinated animals,DIVA）还存在一定的技术障碍。因此,我们需要将C株开发为标记疫苗株,使其具备标记的特性,在猪瘟净化工作上继续发挥优势。本实验室前期研究发现,单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）HQ06是CSFV E2蛋白的特异性抗体,并鉴定其识别的抗原表位为116LFDGTNP122,且117F、119G和122P是该表位的3个关键氨基酸。本研究旨在利用实验室已建立的CSFV反向遗传操作平台,通过突变LFDGTNP抗原表位的关键氨基酸,将C株开发为标记疫苗。在本研究中,我们首先利用CSFV反向遗传操作平台,以C株为骨架,将CSFV E2蛋白LFDGTNP抗原表位的3个关键氨基酸117F、119G和122P分别突变为丙氨酸（A）,构建了3个突变C株的感染性克隆,并在SK6细胞中成功拯救到3株突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A。其次,将构建的3株突变体病毒感染SK6细胞,对突变体病毒的体外生物学特性进行了系统评价。然后,将3株突变体病毒以耳缘静脉途径分别接种家兔后,检测突变体病毒在家兔上的定型热反应和脾脏中的复制情况,并评价突变体病毒诱导家兔产生的抗体能力以及抗体与LFDGTNP抗原肽的反应性等。最后,将家兔实验中筛选到的具有标记特性的突变体病毒rHCLV-E2P122A通过肌肉注射的方式接种断奶仔猪,并评价该病毒诱导仔猪产生中和抗体的能力以及产生的抗体与LFDGTNP抗原肽的反应性等。细胞试验结果表明,本研究构建的3株突变体病毒均失去了与MAb HQ06的反应性;3株突变体病毒遗传稳定,在SK6细胞中连续传代20次后病毒并未回复突变;突变体病毒在SK6细胞上的生长能力滞后于亲本病毒,但在感染后60 h,rHCLV-E2P122A的病毒滴度可达到于亲本病毒相当的水平。家兔试验结果显示,3株突变体病毒均保留了类似亲本C株诱导家兔产生定型热反应的生物学特性,突变体病毒在家兔脾脏中复制且并未回复突变;免疫后7 d,接种突变体病毒的家兔血清中抗CSFV E2抗体全部转阳;但是仅接种rHCLV-E2P122A的家兔血清与LFDGTNP抗原肽不反应,而接种C株和其它突变体病毒的家兔血清可与LFDGTNP抗原肽发生特异性反应。家猪接种试验结果显示,突变体病毒rHCLV-E2P122A接种断奶仔猪后,仔猪并未出现任何临床症状;免疫后28 d,试验组猪只血清中的抗CSFV E2抗体全部转阳,病毒中和抗体滴度最高可高于1:240;更为重要的是,接种rHCLV-E2P122A的仔猪的血清不与LFDGTNP抗原肽反应,而接种C株的仔猪的血清与LFDGTNP抗原肽存在特异性反应。总之,本研究利用CSFV反向遗传操作平台,将CSFV E2蛋白122P定点突变为122A构建的突变体病毒rHCLV-E2P122A在一定程度上赋予了C株DIVA的特性,可作为C株标记疫苗候选株使用。本研究为研制猪瘟标记弱毒疫苗提供了可行的思路和方法,为我国的猪瘟净化提供了有力的技术支持。