【摘 要】
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【背景】2020年全球最新癌症负担数据显示乳腺癌已经成为全球新诊断人数最多的癌症。三阴性乳腺癌约占所有乳腺癌15%,因其缺乏内分泌及抗HER2治疗的靶点,目前尚无针对性的标准治疗方案。因此,找到与三阴性乳腺癌发生发展相关的基因并研制出治疗靶点药物将有可能为乳腺癌患者提供新的治疗方案。PARP1是DNA修复过程中的关键酶,BRCA1基因缺陷的TNBC细胞对PARP1抑制剂敏感。目前PARP1抑制剂被
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【背景】2020年全球最新癌症负担数据显示乳腺癌已经成为全球新诊断人数最多的癌症。三阴性乳腺癌约占所有乳腺癌15%,因其缺乏内分泌及抗HER2治疗的靶点,目前尚无针对性的标准治疗方案。因此,找到与三阴性乳腺癌发生发展相关的基因并研制出治疗靶点药物将有可能为乳腺癌患者提供新的治疗方案。PARP1是DNA修复过程中的关键酶,BRCA1基因缺陷的TNBC细胞对PARP1抑制剂敏感。目前PARP1抑制剂被广泛用于BRCA基因缺陷的卵巢癌患者的治疗,但是在对乳腺癌的治疗中仍处于三期临床试验阶段。PCBP2,作为RNA结合蛋白家族的成员,能够对目的转录本进行特异性结合并发挥转录后调控的功能。我们前期通过对331例乳腺癌患者进行免疫组化分析发现PCBP2在乳腺癌组织细胞的胞核中呈现出高表达状态,并与患者的不良预后相关,而PARP1与PCBP2的核表达水平呈正相关关系。我们推测这可能与PCBP2发挥转录后调控功能相关。【目的】1.探究PCBP2对PARP1的调控关系网络;2.研究PCBP2是否影响PARP1抑制剂耐药的过程【方法】（1）在47例乳腺癌患者的连续切片组织中检测PCBP2与PARP1的表达情况,根据染色评分和运用卡方检验分析方法判断两者之间是否相关;（2）进行PCBP2的蛋白质免疫沉淀反应,将沉淀下来的互作蛋白银染送质谱鉴定;（3）构建PCBP2敲除细胞系PCBP2-/-SUM149PT;（4）在敲除PCBP2前后的细胞系中检测PARP1的RNA与蛋白表达情况;（5）运用RNA免疫荧光和RNA核质分离技术鉴定敲除PCBP2前后PARP1m RNA在细胞中的定位与表达情况;（6）RIP实验用来鉴定PCBP2能否结合PARP1的m RNA;（7）利用转录抑制剂作用于敲除PCBP2前后的细胞中不同时间,RT-qPCR检测PARP1 RNA的降解速率;（8）通过共转染含有PARP1 3’UTR全长的双荧光素酶报告基因质粒和含PCBP2可能结合位点序列的质粒,找出PARP1与PCBP2相互作用的序列;（9）在敲除PCBP2前后的细胞系中加入Olaparib测定细胞对药物的敏感性;（10）浓度递增诱导方法成功诱导出两株对Olaparib耐药的细胞:HCC1937 OR（RI=4.69±0.67）、SUM149PT OR（RI=10.45±1.02）;（11）FISH与Western Blot检测PARP1、PCBP2在耐药株与亲本株表达情况。【结果】（1）在乳腺癌患者组织中,PARP1与PCBP2表达呈正相关（χ2=7.875,P=0.005）且高表达PARP1的患者无病生存期（P=0.047）与总生存期（P=0.01）比低表达的患者短;（2）我们将沉淀下来的蛋白质进行质谱分析找出518个与PCBP2相互作用的蛋白,进行GO分析后发现这些蛋白主要参与RNA代谢跟翻译;（3）Western Blot、q RT-PCR、RNA FISH、RIP表明PCBP2能通过结合PARP1的m RNA影响其蛋白、RNA表达,但不影响RNA定位;（4）将DNA的转录过程抑制后发现敲除PCBP2后PARP1的降解速率加快;（5）报告基因结果显示PCBP2能够与PARP1 3’UTR上富含CU序列相结合发挥稳定RNA降解的作用;（6）CCK8检测敲除PCBP2后乳腺癌细胞失去了对Olaparib的敏感性;（7）FISH与Western Blot显示细胞对Olaparib耐药后,PARP1蛋白表达上升,定位仍在核内;而胞内的DNA损伤减少,PCBP2降低,说明耐药细胞对DNA损伤修复功能恢复,PCBP2参与了这个过程。【结论】（1）PCBP2通过结合PARP1 3’UTR上富含CU序列发挥稳定RNA降解的作用;（2）敲除PCBP2后细胞对Olaparib耐受增高;（3）乳腺癌细胞对Olaparib耐药后DNA损伤修复功能恢复
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