目的：乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，全球每年约120万人被确诊为乳腺癌，每年约有70万人死于此类疾病，在所有癌症引发的死亡中排名第三，仅次于肺癌和胃癌。乳腺癌的发病机制十分复杂，表皮生长因子受体2（Her2）在20-30%的乳腺癌中过表达，而且与患者的不良预后密切相关。因此探索Her2相互作用分子的生物学功能、阐明相关的分子机制对于深入了解Her2阳性乳腺癌的病理生理学过程及改善患者的预后具有重要意义。Erbin是应用酵母双杂技术研究Her2相互作用蛋白时被发现的，因其可与Her2发生直接的，特异的相互作用，故命名为Her2/ErbB2相互作用蛋白（ErBb2interaction protein），简称Erbin。Erbin广泛表达于正常的上皮组织中。已有研究证实，Erbin可以负向调控Her2下游RAS-RAF-ERK信号通路的活化。但在Her2阳性乳腺癌中Erbin的表达水平及表达模式尚不清楚，Erbin在Her2阳性乳腺癌中的生物学功能及对其恶性演进过程的影响亦未见报道。本次研究中，发现在Her2阳性乳腺癌组织中，Erbin的表达显著降低，甚至出现了表达丢失的现象。实验结果表明，在Her2阳性的乳腺癌细胞中敲低Erbin表达可明显增强细胞的迁移能力，诱导乳腺癌细胞出现侵袭表型。同时还发现，敲低Erbin表达可诱导Her2阳性的乳腺癌细胞对治疗性单抗赫赛汀产生抗性。分子机制的研究表明，敲低Erbin主要通过诱导AKT信号通路的异常活化来实现上述的生物学效应。这些结果提示，Erbin通过调控AKT信号通路影响乳腺癌细胞的迁移能力及对赫赛汀的耐药，从而可能在Her2阳性乳腺癌的恶性演进过程中发挥着重要作用。方法：应用Erbin特异性抗体、通过免疫组织化学染色在人乳腺癌组织芯片中检测Erbin在蛋白水平的表达情况；通过Oncomine数据库检索，探索在Her2阳性的乳腺癌组织中Erbin在mRNA水平的表达情况；通过免疫印迹法及实时定量PCR检测在乳腺癌细胞系中，Erbin在转录水平及蛋白水平的表达情况；设计并构建了Erbin shRNA表达载体，通过细胞转染、病毒感染以及蛋白质免疫印迹，检测在Her2阳性乳腺癌细胞中敲低Erbin表达对Heregulin诱导的AKT信号通路活化的影响；通过构建Erbin真核表达载体、细胞转染及免疫印迹法检测了，在Her2阳性的乳腺癌细胞中过表达Erbin对Heregulin诱导的AKT活化的影响；通过CCK8（细胞增殖检测），探索敲低Erbin表达对Her2阳性乳腺癌细胞增殖的影响；通过流式细胞术，检测敲低Erbin表达对Her2阳性乳腺癌细胞的细胞周期行进的影响；通过二维培养条件下的细胞划痕实验，检测了敲低Erbin表达对Her2阳性乳腺癌细胞迁移能力的影响；通过Matrigel细胞三维培养法，检测敲低Erbin表达对Her2阳性乳腺癌细胞侵袭表型形成的影响；应用AKT及ERK信号通路的特异性抑制剂，探索敲低Erbin影响细胞迁移及侵袭表型形成的分子机制；通过细胞增殖检测实验，检测敲低Erbin表达对靶向Her2的治疗性抗体-赫赛汀细胞增殖抑制效应的影响；通过细胞海绵三维细胞培养法，检测敲低Erbin对Her2阳性乳腺癌细胞赫赛汀耐药的影响；通过细胞锚定非依赖增殖检测法，探索敲低Erbin表达对Her2阳性乳腺癌细胞的赫赛汀敏感性的影响；应用AKT及ERK特异性抑制剂，探索Erbin影响Her2阳性乳腺癌细胞赫赛汀耐药的分子机制。结果：1Erbin在乳腺癌及Her2阳性乳腺癌组织中表达显著降低免疫组化的结果表明，在所检测的10例正常乳腺组织中，8例呈现Erbin高表达（++-+++）；而在20例浸润性乳腺癌组织中，Erbin的表达水平普遍偏低，甚至出现了表达丢失的现象。15例乳腺癌组织Erbin的表达水平为“+”或阴性，仅5例为“++”。在Oncomine数据库检索时发现了一组含有53例浸润性乳腺癌的样本。通过与正常乳腺组织进行比较，发现这是一组高Her2阳性率的乳腺癌样本，在53例样本中有52例为Her2阳性，仅有1例为Her2阴性。同时检索了该组样本中Erbin在mRNA水平的表达情况。结果表明，在52例样本中Erbin mRNA的水平都显著低于正常乳腺组织，仅有一例例外。这一发现与之前在乳腺癌组织芯片中检测得到的结果相符，提示Erbin表达水平在Her2阳性乳腺癌组织中显著下降。通过对该组患者的预后进行分析发现，与那些三年内未出现肿瘤复发的患者相比，三年内出现复发的患者标本中Erbin表达水平的下调更为显著。提示Erbin在Her2阳性乳腺癌的恶性演进过程中可能发挥着重要作用。此外本次实验还应用Western-blot及实时定量RT-PCR法检测了人乳腺上皮细胞MCF-10A及5种乳腺癌细胞系（MCF-7、MCF-7/Her2、MDA-453、T47D、MDA-435）中检测了Erbin在转录水平和蛋白水平的表达情况。实验结果表明，在转录水平，MCF-7、MCF-7/Her2及T47D细胞的Erbin表达明显低于MCF-10A细胞。而MDA-453细胞Erbin表达显著高于MCF-10A细胞。在蛋白水平，与MCF-10A细胞相比，MCF-7、MCF-7/Her2、MDA-453、MDA-435细胞Erbin的表达水平相对较低。2Erbin可在Her2阳性乳腺癌细胞中负调控AKT信号通路的活化设计并构建了Erbin shRNA的慢病毒表达载体，利用慢病毒感染的方法获得了三株稳定敲低Erbin的乳腺癌细胞（均为Her2阳性乳腺癌细胞），分别命名为MDA-453-Erbin-sh、 SKBR3-Erbin-sh和MCF-7/Her2-Erbin-sh。Western-blot检测结果表明，在这三种感染Erbin shRNA慢病毒的细胞中，Erbin的表达被显著抑制。同时，将感染表达对照shRNA慢病毒的细胞作为对照组。通过应用Her2的激活分子Heregulin分别刺激上述乳腺癌细胞，检测Her2下游的主要促生存信号通路的变化。实验结果表明，在MCF-7/Her2对照细胞中，Heregulin的刺激可以使AKT的磷酸化发生一个先升后降，如同“抛物线”样的变化;但在MCF-7/Her2-Erbin-sh细胞中，Heregulin刺激所造成的AKT的磷酸化，无论强度还是持续的时间都明显强于对照细胞。在MDA-453细胞中，Heregulin的刺激可以使对照细胞的AKT出现一个先快速磷酸化继而缓慢下降的过程，虽然沉默Erbin的表达并没有显著提高p-AKT的水平，但是造成了AKT的持续活化，即使在刺激六小时后，其活化程度依然没有明显的衰减。在SKBR3-Erbin-sh细胞中也得到了同样的结果，即在高表达Her2的乳腺癌细胞中，Erbin表达下调可增强由Heregulin诱导的AKT的磷酸化。上述实验表明，在高表达Her2的乳腺癌细胞中，Erbin表达的缺失可增强由Heregulin诱导及Her2激活所导致的AKT的磷酸化。为进一步探讨Erbin对AKT信号通路的调控作用，实验中构建了Erbin的真核表达载体，并将其瞬时转染Her2阳性乳腺癌细胞MCF-7/Her2和MDA-453，转染48小时后用无血清的培养基饥饿细胞过夜，然后用Heregulin刺激细胞。Western Blot的结果显示，Erbin过表达可显著抑制Heregulin诱导的AKT活化。这进一步证明了，在高表达Her2的乳腺癌细胞中，Erbin对于Heregulin诱导的AKT信号通路活化具有负向调控作用。3Erbin缺失可促进AKT信号依赖的细胞迁移及侵袭为进一步探索Erbin表达降低在Her2阳性乳腺癌恶性演进过程中的意义。首先通过体外划痕实验进行检测敲低Erbin表达对Her2阳性乳腺癌细胞迁移能力的影响。结果表明，在MCF-7/Her2细胞中敲低Erbin的表达可以显著加速创口的愈合,而且在Heregulin存在的情况下这种促进作用更为明显。实验采用以基质胶为基础的三维细胞培养法探索Erbin对Her2阳性乳腺癌细胞侵袭能力的影响。实验结果表明，对照细胞可以在三维细胞培养体系中形成边缘规则的球形结构，而大部分（80%）的Erbin低表达细胞在三维体系中形成边缘极不规则且具有侵袭样结构的球体。上述结果表明，在Her2阳性乳腺癌细胞中沉默Erbin表达，可增强细胞迁移和侵袭能力。为进一步探索此过程中的精确分子机制，在划痕实验中使用了AKT特异性的抑制剂GDC0941。Western-blot的结果表明，GDC0941可特异性抑制AKT的磷酸化，而不影响ERK的磷酸化。划痕实验的结果表明，GDC0941能够显著逆转Erbin表达缺失对细胞迁移能力的影响，证实了AKT的活化可能在此过程中发挥了重要作用。那么ERK作为Her2下游另一条重要的信号通路，它的激活是否也参与Erbin表达缺失诱导的细胞迁移能力增强呢？为了回答这一问题，本次实验选用了ERK的特异性抑制剂PD184352。结果表明，PD184352它可以在不影响AKT磷酸化的前提下，特异性抑制ERK的磷酸化。划痕实验的结果表明，PD184352并不能逆转敲低Erbin表达所诱导的细胞迁移。以上实验结果表明，在Her2阳性的乳腺癌细胞中，Erbin表达缺失以AKT信号通路依赖的方式促进Her2阳性乳腺癌细胞迁移及侵袭表型形成。4敲低Erbin表达诱导AKT信号依赖的赫赛汀耐药目前靶向Her2的治疗性抗体-赫赛汀是Her2阳性乳腺癌的主要治疗手段之一。然而赫赛汀耐药是制约此药物发挥疗效及造成患者不良预后的重要原因。阐明赫赛汀耐药的相关机制、发现预测及克服耐药的分子靶标具有重要意义。应用不同浓度的赫赛汀分别处理表达对照shRNA及表达Erbin shRNA的MCF-7/Her2细胞。在连续刺激5天后，采用CCK8细胞增殖实验，检测了敲低Erbin表达对赫赛汀细胞增殖抑制效应的影响。实验结果表明，在对照组细胞中，赫赛汀可显著抑制细胞的增殖，并呈现出良好的量效关系。在敲低Erbin的MCF-7/Her2细胞中，赫赛汀虽然可以在一定程度上抑制细胞增殖并具有量效关系。但是与对照细胞相比，相同浓度赫赛汀对敲低Erbin的MCF-7/Her2细胞的增殖抑制率显著降低。这提示，敲低Erbin表达可能诱导Her2阳性乳腺癌细胞对赫赛汀产生耐药。为进一步排除此现象的细胞特异性，实验中选取MDA-453细胞重复进行了上述实验。实验结果表明，敲低Erbin表达可诱导MDA-453细胞对赫赛汀产生耐药。由于在二维培养和三维培养条件下，肿瘤细胞对药物的敏感性可能存在差异。本次实验应用细胞海绵（cellusponge）三维细胞培养法检测了敲低Erbin表达对MDA-453细胞赫赛汀敏感性的影响。实验结果显示，赫赛汀可完全抑制对照细胞在细胞海绵中的生长。而敲低Erbin表达不但可以增加MDA-453细胞在细胞海绵中的克隆体积，还可以诱导MDA-453细胞对赫赛汀产生耐药。在接下来的实验中，采用了软琼脂细胞克隆形成实验进一步检测了敲低Erbin表达对MDA-453细胞赫赛汀抗性的影响。实验结果显示，赫赛汀可显著抑制对照细胞的锚定非依赖性生长，而在敲低Erbin的细胞中，这种抑制效应显著减弱。此结果进一步支持了这一假设，即Erbin表达缺失可诱导Her2阳性乳腺癌细胞对赫赛汀产生抗性。为进一步探索敲低Erbin表达诱导Her2阳性乳腺癌细胞赫赛汀抗性的分子机制，本次实验检测了AKT及ERK信号通路在敲低Erbin表达诱导赫赛汀耐药过程中的作用。通过细胞增殖实验发现，在对照细胞中赫赛汀可抑制AKT的诱导剂Heregulin诱导的细胞增殖。但是在敲低Erbin的细胞中，赫赛汀不能抑制Heregulin诱导的细胞增殖。AKT的抑制剂GDC0941可显著逆转由于敲低Erbin导致的赫赛汀耐药，而ERK特异性抑制剂PD184352不能逆转敲低Erbin诱导的赫赛汀耐药。这一结果提示，Erbin表达缺失主要通过诱导AKT信号的异常活化诱导Her2阳性乳腺癌细胞赫赛汀耐药的发生。结论：1在乳腺癌及Her2阳性乳腺癌组织中Erbin表达水平显著下调2在Her2阳性的乳腺癌细胞中Erbin负向调控了AKT信号通路。3Erbin表达缺失以AKT信号通路依赖的方式促进Her2阳性乳腺癌细胞迁移及侵袭表型形成。4Erbin表达缺失以AKT信号通路依赖的方式诱导Her2阳性乳腺癌细胞赫赛汀耐药。