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第一部分 转录因子PAX3在胶质瘤干细胞中的表达及生物学作用背景与目的转录因子PAX3作为配对盒转录子家族一员,其不仅在神经系统胚胎发育过程中发挥重要作用,而且在神经胶质瘤的发生发展过程中起着重要作用。我们前期工作中发现PAX3在人脑神经胶质瘤组织中呈高表达,且与神经胶质瘤恶性程度密切相关。胶质瘤干细胞作为种子细胞是胶质瘤发生、发展、治疗失败和复发的根源。本部分旨在研究转录因子PAX3在人脑胶质瘤干细胞中表达及对人脑胶质瘤干细胞凋亡、增殖、侵袭及分化等生物学行为的影响,进一步探讨其在人脑胶质瘤发生发展过程中所起的作用。方法 1、对人脑胶质瘤干细胞系GSC11进行细胞培养及干细胞鉴定。通过单克隆实验验证胶质瘤干细胞的克隆形成能力；2、采用实时荧光定量PCR (RT-PCR)与免疫印迹技术(Western Blot)检测人脑胶质瘤干细胞系GSC11、人脑胶质瘤细胞系U87及人脑神经胶质细胞系1800中转录因子PAX3的表达；3、通过转染PAX3真核过表达质粒及小分子干扰RNA技术(siRNA)分别对GSC11细胞中转录因子PAX3进行过表达和干扰表达,采用RT-PCR和Western Blot检测过表达和干扰效果。采用Western Blot检测干扰PAX3表达后对胶质瘤干细胞标志物CD133及Nestin表达的影响。流式细胞仪检测GSC11细胞凋亡率；CCK-8法检测GSC11细胞增殖能力；微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统(Transwell小室实验)检测GSC11细胞侵袭能力；建立胶质瘤干细胞诱导分化模型,采用细胞免疫荧光法检测对GSC11细胞分化的影响。结果1、细胞免疫荧光检测显示GSC11细胞中CD133和Nestin表达阳性,单克隆实验证实细胞具有良好的克隆形成能力,悬浮生长的胶质瘤干细胞聚集成球；2、RT-PCR与Western Blot发现GSC11细胞与U87细胞中PAX3的mRNA和蛋白表达水平均显著高于1800细胞。3、转染或者干扰后GSC11细胞中的PAX3的mRNA及蛋白表达水平较对照组明显增高或者降低。4、干扰PAX3表达后GSC11细胞中CD133及Nestin表达水平明显下降。5、过表达PAX3后明显抑制GSC11细胞凋亡,细胞增殖能力明显增强,且细胞侵袭能力显著提高；而抑制PAX3表达则明显促进GSC11细胞凋亡,细胞增殖能力明显下降,且细胞侵袭能力显著降低；6、细胞免疫荧光法发现过表达PAX3的GSC11细胞分化明显减弱,GFAP阳性细胞率显著降低；而抑制PAX3表达的GSC11细胞分化明显增强,GFAP阳性细胞率显著升高。胶质瘤干细胞分化过程中转录因子PAX3表达与GFAP阳性细胞数呈负相关。结论转录因子PAX3在胶质瘤干细胞中呈高表达。转录因子PAX3表达与胶质瘤干细胞生物学行为密切相关。抑制PAX3的表达可促进胶质瘤干细胞凋亡与分化,抑制胶质瘤干细胞增殖与侵袭能力。转录因子PAX3有望成为胶质瘤干细胞治疗新的靶分子。第二部分转录因子PAX3对胶质瘤干细胞中胶质纤维酸性蛋白基因的转录调控机制背景与目的胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)是星形胶质细胞中主要的中间纤维素蛋白,参与构成细胞骨架,在中枢神经系统多能干细胞向星形细胞分化的过程中起着关键作用,GFAP基因表达功能状态对于胶质瘤细胞的生物学功能也有重要影响。本文第一部分研究发现在胶质瘤干细胞向星型胶质细胞分化过程中转录因子PAX3与GFAP阳性细胞率呈负相关。本部分旨在进一步研究转录因子PAX3对胶质瘤干细胞中GFAP基因的转录调控机制。方法1、采用RT-PCR与Western Blot检测人脑胶质瘤干细胞系GSC 11、人脑胶质瘤细胞系U87及人脑神经胶质细胞系1800中GFAP的表达；2、RT-PCR与Western Blot检测转染过表达PAX3及siRNA干扰降低PAX3表达后GSC11细胞中GFAP表达,并分析PAX3与GFAP表达相关性；3、通过染色质免疫共沉淀法(ChIP Assay)检测转录因子PAX3在GSC11细胞中与GFAP基因启动子相应区域结合情况；4、予以构建正常及突变的人GFAP启动子报告基因质粒,通过荧光素酶报告分析系统(Luciferase Assay)检测转录因子PAX3对GFAP基因启动子相应结合位点的转录调控活性；5、依据测得的GFAP基因启动子PAX3转录结合位点来设计探针序列,采用电泳迁移率试验(EMSA)进一步验证转录因子PAX3与GFAP基因启动子相应位点结合情况。结果1、RT-PCR与Western Blot发现GSC11细胞与U87细胞中GFAP的mRNA和蛋白表达水平明显低于1800细胞；2、转染过表达PAX3后GSC11细胞中GFAP的mRNA和蛋白表达水平明显下降,而siRNA干扰降低PAX3表达后GSC11细胞中GFAP的mRNA和蛋白表达水平明显增加。胶质瘤干细胞中转录因子PAX3表达与GFAP表达呈负相关；3、ChIP实验结果证实转录因子PAX3在GSC11细胞中能与GFAP基因启动子相应区域结合；4、在成功构建正常与突变的GFAP启动子报告基因质粒后,通过Luciferase Assay检测发现过表达PAX3后正常GFAP启动子报告基因荧光素酶活性较对照组明显提高。P1位点突变的GFAP启动子报告基因荧光素酶活性明显下降,而P2位点突变的GFAP启动子报告基因荧光素酶活性无明显下降。转录因子PAX3对GFAP基因启动子具有转录调控作用,且P1为其转录调控位点；5、EMSA实验进一步证实了转录因子PAX3能与GFAP基因启动子结合位点P1特异性结合。结论胶质瘤干细胞中转录因子PAX3表达与GFAP表达呈负相关。转录因子PAX3通过与胶质瘤干细胞中的GFAP基因启动子区域特异性结合,对GFAP基因表达起转录调控作用。