乳恒牙替换是儿童口腔中的正常生理现象，乳牙牙根吸收、牙槽骨改建及恒牙萌出途径形成，是乳牙替换和恒牙正常萌出的先决条件，在这些过程中破骨细胞(osteoclast，OC)和破牙细胞(odontoclast，OD)起着重要作用。1982年Chambers和Magnus[1]首次在体外成功建立破骨细胞培养方法，破骨细胞在体内数量少，且为成熟的终末细胞，不能进行细胞分裂或传代，因此体外培养较困难。目前，多数研究显示破牙细胞在形态、酶活性和代谢功能等方面与破骨细胞相似，所以，破牙细胞的分离培养主要参考破骨细胞，多采用颅盖骨消化法、四肢长骨机械分离法、骨髓培养法等间接获得破骨细胞样细胞(osteoclast—like cell，OLC)，作为破牙细胞的替代细胞，进行与牙体组织和骨组织吸收相关的研究[2]。本研究旨在通过酶消化法直接获取破牙细胞，验证成熟破牙细胞分离培养的可行性，得到与体内形态、功能更为接近的体外生活破牙细胞。 破牙细胞通过分泌多种酶降解细胞外基质参与牙体组织吸收过程，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是其中最主要的酶。目前已发现的MMPs家族成员近30种，根据其结构和底物特异性不同可分为7类。基质金属蛋白酶-12(matrix metalloproteinase-12，MMP-12)又称为金属弹性蛋白酶(metalloelastase)，可独立列为一类，亦或归类于基质溶解素，能降解包括弹力蛋白在内的多种细胞外基质成分，是动脉瘤和肺气肿等病理状态下细胞侵袭和组织破坏的关键酶。有研究显示MMP-12参与动物破骨细胞性骨吸收，并能激活其他MMPs。目前对MMP-12的研究多集中于病理状态。在生理状态下如乳牙牙根生理性吸收过程中，MMP-12的生物学作用尚缺乏相关报道。本实验应用免疫细胞化学技术及免疫荧光技术检测牙根生理性吸收过程中破牙细胞MMP-12的表达情况，为阐释该过程的形成机制提供理论依据。 目的：采用酶消化法在体外成功地分离、培养、鉴定人破牙细胞，验证成熟破牙细胞分离培养的可行性，为后续探讨其功能及调节机制奠定基础；通过免疫细胞化学技术及免疫荧光技术确定乳牙牙根吸收过程中破牙细胞MMP-12的表达情况，为阐明牙根生理性吸收的机制提供理论依据。 材料与方法：①收集中山大学附属口腔医院儿童口腔科就诊的患儿因滞留而拔除的健康乳牙，拔出后即刻浸泡于α—最低基础培养基(α—minimum essential medium，α—MEM)，低温保存；离体健康吸收乳牙以含0.1％胶原酶(collagenase)及0.2％分散酶(dispase)的α—MEM溶液37℃消化1h后，冲洗吸收根面，过滤、离心得到细胞沉淀，孵育培养。②人破牙细胞的组织形态学鉴定，包括倒置相差显微镜下观察活细胞形态、苏木素—伊红染色(hematoxylin and eosin staining，HE染色)及抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartaric—resistant acid phosphatase staining，TRAP染色)，胞核用DAPI荧光染料进行复染。③人破牙细胞的功能活性鉴定，将分离所得的细胞与人牙硬组织薄片共培养，扫描电镜(scanning electron microscopy，SEM)下观察牙薄片上形成的吸收陷窝。④利用兔抗人MMP-12的单克隆抗体，采用免疫细胞化学技术和免疫荧光技术，鉴定乳牙牙根生理性吸收过程中破牙细胞MMP-12的表达情况。 结果：①体外成功分离、培养人破牙细胞。倒置相差显微镜下观察，离体细胞孵育2小时后，贴壁良好，伪足明显，胞核数目不等，一个至多个，清晰可见，胞浆内可见吸收空泡。②HE染色可见大部分破牙细胞为多核巨细胞，胞核蓝染；TRAP染色见破牙细胞胞浆布满特异性的抗酒石酸酸性磷酸酶颗粒，呈特征性的酒红色，大部分细胞具有多个胞核，荧光显微镜下呈蓝色荧光。③通过SEM观察，破牙细胞在人牙硬组织薄片上形成圆形、椭圆形吸收陷窝，陷窝边界清晰，底部粗糙、胶原暴露。④免疫细胞化学技术和免疫荧光技术检测表明，体外培养人破牙细胞中MMP-12在胞浆中分别呈棕色、荧光红色着色，核周着色较深。 结论：①应用酶消化法可从离体吸收乳牙中成功分离获取人破牙细胞。②破牙细胞胞浆呈MMP-12阳性表达，提示MMP-12可能被分泌到胞外，降解有机基质，参与乳牙牙根生理性吸收过程。