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背景肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigen, TAA)是指细胞癌变的过程中,出现的一些新的抗原和过度表达的抗原的总称。而在癌症血清中也被许多研究证实有抗肿瘤相关抗原抗体的存在。这些抗肿瘤相关抗原抗体被许多研究者作为生物标志物评价其在肿瘤诊断中的价值。肿瘤相关抗原p62是本实验室通过对肝癌病人血清进行cDNA文库筛选的方法克隆得到的与肝癌相关的类胰岛素样生长因子2的mRNA结合蛋白质(insulin-like growth factor2mRNA binding protein2,IGF2BP2),因为该蛋白质分子量为62kDa,所以又被命名为p62。现在,许多学者又将联合与肿瘤发生密切相关的多种抗肿瘤相关抗原抗体进行综合研究,以评价其在肿瘤发生过程中的意义。目的1.对肿瘤相关抗原p62的蛋白质二级结构和功能以及与其相互作用的蛋白质进行预测,为后续实现p62蛋白分子晶体的构建制备和研究其三级结构提供初始数据支持,为以后针对p62分子功能及信号通路的研究提供方向和数据指导；2.利用RNA干扰技术沉默p62在人肝癌细胞系的表达,观察它对肝癌细胞的生物学效应,为探索肿瘤相关抗原p62的分子功能和肝癌的临床免疫诊断提供实验依据；3.评价p62联合其他9种肿瘤相关抗原微阵列在乳腺癌诊断中的价值。方法1.采用p62的蛋白质序列和基因序列,使用PSIPRED2.0、SSpro、Jpred、 PDB、PROF-predictprotein预测网站对蛋白质的二级结构(螺旋,直链,无规则卷曲进行预测。2.采用p62的蛋白质序列和基因序列,利用DNASTAR预测软件和String预测网站用于对p62的蛋白质特性和互作蛋白质进行预测。3.设计构建p62基因的含有shRNAs(short hairpin RNA)干扰载体,利用脂质体转染技术,转染入人类肝癌细胞株SNU-449中,利用Western-blot技术检测p62基因的沉默表达情况；选取有效基因沉默表达的细胞系,使用荧光显微镜和流式细胞仪观察转染效率,检测转染后SNU-449细胞的生长曲线。4.利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测乳腺癌患者血清和正常血清中十种抗TAAs ((Imp1,p62,Koc, p53, c-myc, survivin, p16, cyclin B1, cyclinD1, CDK2)抗体,并使用流行病与卫生统计学方法评价结果的真实性。结果1.研究结果显示,p62蛋白的抗原表位指数较高,螺旋区域所占二级结构中三种构象的百分比可能为21%,直链区域可能为28%,无规则区域可能为51%。2.互作蛋白质的预测提示p62可能与9种蛋白质有相互作用。这9种蛋白质为IGF2(insulin-like growth factor2), CDKAL1:(CDK5regulatory subunit associated protein1-like1), SLC30A8(solute carrier family30, member8), HHEX (hematopoietically expressed homeobox), TCF7L2(transcription factor7-like2), FTO (fat mass and obesity associated), TCF7(transcription factor7), WFS1(Wolfram syndrome1), KCNJ11(potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member11)。除了参与胰岛素样生长因子的转录之外,有可能也参与到细胞内锌转运,钙离子浓度调节,淋巴细胞分化的转录激活等细胞活动。3.针对p62基因的4个靶位点序列(211-231,1102-1122,1126-1146,1369-1389)构建的RNA干扰载体转染入人类肝癌系SNU-449细胞后,发现靶位点位于1369-1389的干扰载体对应的p62蛋白表达量下降最为明显,提示p62的RNA干扰载体能沉默p62蛋白在肝癌细胞SNU-449中的表达；p62基因的RNA干扰载体转入SNU-449细胞后,细胞增殖出现了明显的抑制,提示p62蛋白能促进人类肝癌细胞SNU-449的细胞生长。4.将p62蛋白作为微阵列芯片中的一种肿瘤相关抗原,与微阵列中其它多种肿瘤相关抗原联合对乳腺癌患者进行了检测。单个TAAs在乳腺癌中的抗体出现频率介于7.3%和22.0%之间。但是在对乳腺癌患者血清的检测中,随着TAAs的数目被依次逐个增加到8个时,抗体的阳性反应逐步提高,灵敏度达到61.0%,特异度达到89.0%,阳性和阴性似然比分别为5.545和0.438,表明8个TAAs平行检测乳腺癌的临床诊断价值很高。PPV和NPV分别为73.5%和82.0%,表明联合8个TAAs抗体的检测显著提高了诊断的准确度。一致率和kappa值分别为79.7%和0.52,这表明这个试验的观察值与实际值之间存在中等范围的同步性。结论1.p62蛋白是可以以抗原形式存在的、表面比较光滑的柔性可溶性蛋白质。2.对与p62蛋白相互作用的蛋白预测结果提示,p62蛋白可能对肿瘤细胞内一些离子的稳定和浓度有一定的影响,从而影响肿瘤细胞的生长、分化。另一方面,p62蛋白也可能参与了人类2型糖尿病的致病机理。3.p62基因的有效沉默表达靶位点位于基因序列1369-1389处。shRNA干扰p62可以明显降低人类肝癌细胞系SNU-449中的p62基因的表达并抑制人类肝癌细胞SNU-449细胞增殖；同时表明p62可以促进人类肝癌细胞SNU-449的增殖。4.包含p62在内的8种(c-myc, survivin, cyclinBl, cyclinDl,p62,p53, p16, CDK2)肿瘤相关抗原微阵列检测乳腺癌,对乳腺癌诊断具有较高的价值,为临床中乳腺癌的诊断提供一种全新的方法。