论文部分内容阅读
乳腺癌作为一种高发性肿瘤,它的预防和治疗在生物界和医学界越来越受到重视,寻求一种新型有效且低毒性的抗乳腺癌药物迫在眉睫。近年来植物来源的胰蛋白酶抑制剂预防和抵制癌症的功能已成为一个热点受到特别关注。本课题组前期研究发现：来自荞麦中的重组胰蛋白酶抑制剂rBTI(recombinant buckwheat trypsin inhibitor)可以抑制人类白血病细胞(K562,HL60)以及人类实体瘤细胞HepG2, EC9706 等的增殖,并促进细胞凋亡。但rBTI抑制肿瘤细胞增殖以及其促进细胞凋亡的机制和分子靶点还尚不明确。研究发现,NFKB/p65信号通路在乳腺癌细胞的产生和发展中起着较为关键的作用。为了探究重组荞麦胰蛋白酶抑制剂rBTI对人乳腺癌细胞MCF-7的作用及其机制,本研究主要开展以下研究内容：1、采用MTT法进行检测,发现rBTI能够明显的抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,并呈现出一种剂量依赖的方式。划痕愈伤实验表明rBTI可抑制MCF-7细胞迁移。用不同浓度的rBTI对MCF-7细胞进行处理后,通过流式细胞术对MCF-7细胞周期和凋亡情况进行检测,发现细胞周期进程受到阻滞并出现明显的凋亡现象。qRT-PCR和Western Blot检测周期相关因子p53、CDK1、CDK2及细胞凋亡相关因子Fas、Bax、Bc1-2在mRNA水平和蛋白水平的表达量,发现促凋亡基因显著表达,而抑凋亡基因表达量明显减少。2、不同浓度的rBTI对MCF-7细胞进行处理后,运用Western Blot技术和qRT-PCR对NFκB/p65途径中p65、IκBα、IKKα/β在转录水平、翻译水平的表达量进行检测；通过免疫荧光技术检测p65的核转位,结果显示IKKa/p表达量显著升高、IκBα发生了明显的磷酸化,同时p65蛋白在细胞质内逐渐减少、在细胞核内逐渐增多。流式细胞术检测结果表明rBTI可促使ROS水平升高,当NAC将ROS抑制后,可从Western blot结果看出IκBα的磷酸化情况明显减小,NF-KB/p65核转位也相对减少。说明NF-KB/p65信号通路的激活与ROS的增加相关。由此可见,rBTⅠ可促进ROS的产生,IκBα的磷酸化降解,从而诱导p65蛋白的核转位,激活NF-κB/P65信号通路。综上所述,rBTI阻断MCF-7细胞周期进程,促进MCF-7细胞凋亡,可能是通过激活MCF-7细胞中NFKB/p65信号通路。3、rBTI和紫杉醇都具有抑制肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡等作用,但两者联合用药对肿瘤细胞的影响尚不明确。本研究通过MTT比色法对rBTI与紫杉醇联合用药对MCF-7细胞增殖的影响进行检测；采用流式细胞术对MCF-7细胞的凋亡以及ROS水平进行检测；利用qRT-PCR和Western印迹方法,检测rBTI与紫杉醇联合作用后凋亡因子表达情况。结果表明,rBTI(2.5μM)与紫杉醇(0.05-0.5μM)联合作用于MCF-7细胞后,能显著抑制其增殖。将rBTI与紫杉醇进行联合作用于MCF-7细胞,诱导了MCF-7细胞的凋亡及ROS的产生；同时与rBTI单独作用时相比,联合作用明显上调了p53、Bax的表达,促进了IκBα蛋白的磷酸化以及NFκB/P65的核转位；与rBTI组和紫杉醇单独作用组相比,两者联合用药明显下调了Bcl-2和Cyclin D1的表达。本研究证实,rBTI联合紫杉醇可诱导ROS的产生,激活NFκB/P65信号通路,协同诱导MCF-7细胞的凋亡。以上研究结果为rBTI抗乳腺癌作用的研究奠定了基础,为乳腺癌的治疗和联合用药提供了新的策略。