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皮肤衰老是机体衰老的外部表现,特征为皮肤变薄、弹性降低、皱纹增加、色斑等。随着年龄增大,脂褐素在皮肤表层沉积,引起正常细胞结构与功能损伤,是衰老的生物标志。巨噬细胞氧化应激损伤引起脂褐素是皮肤衰老的关键因素。希望液由枸杞、大枣组成,具有补益五脏,延缓衰老的效果。本研究在整体大鼠与离体细胞模型上,观察希望液防治大鼠皮肤衰老的药效,初步探索药理。实验一希望液延缓大鼠皮肤衰老的药效目的:观察希望液对衰老模型大鼠皮肤脂褐素沉积的影响及延缓皮肤衰老的药效。方法:采用吸入臭氧法复制大鼠衰老模型,各给药组分别灌胃给予阳性对照药(维生素E,13.5mg.kg-1)及低、中、高剂量(225,450,900mg·kg-1)希望液,模型组和正常对照组给予等量蒸馏水。检测大鼠血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)含量;HE染色显示皮肤病变,形态计量表皮角质层体积比;三氯化铁-铁氰化钾染色显示皮肤脂褐素,形态计量表皮脂褐素沉积体积比。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠血清T-SOD、CAT、GSH-Px水平及皮肤表皮角质层体积比显著降低(P<0.05),MDA水平和脂褐素沉积显著升高(P<0.05)。与模型组比较,希望液能升高大鼠血清T-SOD、CAT、GSH-Px水平及皮肤表皮角质层体积比,降低MDA水平和脂褐素沉积;其中希望液各剂量组的T-SOD、MDA水平及脂褐素沉积、中、高剂量组的CAT水平、高剂量组的GSH-Px水平及皮肤表皮角质层体积比与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:希望液通过抑制氧化应激损伤,减少表皮脂褐素沉积,延缓皮肤衰老。实验二希望液延缓大鼠皮肤衰老的药理初探目的:初步探索希望液抑制巨噬细胞氧化应激延缓大鼠皮肤衰老的药理机制。方法:采用吸入臭氧法复制大鼠衰老模型,各给药组分别灌胃给予阳性对照药(维生素E,13.5mg·kg-1)及低、中、高剂量(225,450,900mg·kg-1)希望液,模型组和正常对照组给予等量蒸馏水。采用实时定量RT-PCR或westem blot分别检测皮肤组织SOD3、NOX2的基因表达与蛋白含量,采用免疫组化检测皮肤组织SOD3蛋白原位表达并形态计量其水平。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠皮肤组织SOD3原位表达与蛋白含量显著降低(P<0.05);同模型组比较,希望液各剂量组均不同程度回升SOD3原位表达与蛋白含量。与正常对照组比较,模型组大鼠皮肤组织NOX2的原位表达与蛋白含量均显著增加(P<0.05);同模型组比较,希望液各剂量组均不同程度降低NOX2原位表达与蛋白含量。结论:希望液通过增加SOD3表达,减少NOX2表达,抑制氧化应激损伤,延缓皮肤衰老。实验三巨噬细胞氧化应激诱导皮肤衰老离体模型的建立目的:建立巨噬细胞氧化应激诱导皮肤衰老的体外模型。方法:①Raw264.7巨噬细胞给予梯度浓度H2O2(10-316.22μM,k=0.56),损伤梯度时间(12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h)复制氧化应激,MTT法检测细胞增殖,Prism回归量效与时效,确定H202造模半数有效浓度EC50与半数有效时间ET50。②梯度密度人永生化角质形成细胞HaCat(103.5～105.0cells/ml,k=0.56)培养梯度时间(12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h),MTT法检测细胞增殖,根据细胞接种密度与生长时间对接触性抑制的决定作用,确定半数接种密度MMD50与时间EMT50。③transwell上室接种5梯度密度Raw264.7巨噬细胞(102.5～104.5cells/ml,k=0.32),经H2O2损伤后,与下室接种的HaCat细胞共培养。三氯化铁-铁氰化钾染色显示HaCat细胞内脂褐素并形态计量其含量,Prism回归量效,确定Raw264.7细胞半数接种密度(EMD50)。结果:①H2O2诱导巨噬细胞损伤的量效与时效曲线均呈“S”型,EC50为157.5μM,ET50为55.5h,。②以HaCat细胞接触性抑制效能回归其接种密度的量效与时效曲线均呈“S”型,EMD50为28025cells/ml,EMTs0为99.4h。③在细胞共培养模型中,HaCat细胞内脂褐素堆积水平随巨噬细胞接种密度上升而增加,以脂褐素含量回归量效曲线呈“S”型,巨噬细胞MMD50为5486cells/ml。结论:本实验建立了巨噬细胞诱导皮肤衰老的体外模型,可用于抗皮肤衰老药物筛选及药效评价。实验四希望液单体防治皮肤衰老药效验证目的:确定希望液中有效单体绿原酸、芦丁和甜菜碱延缓皮肤衰老的量效。方法:在皮肤衰老离体模型上,给予含5梯度浓度绿原酸(50000-500nM,k=0.316)、5梯度浓度芦丁(1000-10μM,k=0.316)、5梯度浓度甜菜碱(1000-10μM,k=0..316进行干预,持续99.4h。三氯化铁-铁氰化钾染色显示HaCat细胞内脂褐素并形态计量其含量,Prism回归量效,确定三种中药单体半效抑制有效浓度(IC50)。结果:绿原酸、芦丁、甜菜碱三单体抑制皮肤衰老离体模型HaCat细胞脂褐素沉积,呈剂量依赖趋势,回归量效曲线为“S”型。绿原酸、芦丁和甜菜碱延缓皮肤衰老的IC50分别为9025nM、19.95uM、32.82μM。结论:本文复制了臭氧大鼠皮肤老化模型,评价希望液药效;建立了离体皮肤老化模型,探索巨噬细胞启动氧化应激,导致表皮细胞老化的药理。在动物、细胞和分子3层面上进行分析,确认了方剂的中医优势疗效作用特征与通路靶点