研究背景由于创伤、畸形、肿瘤等疾病导致的骨缺损是骨科医生所面临的十分棘手的难题。传统骨移植手段包括自体骨和异体骨移植。自体骨移植虽是骨修复策略中的金标准，但由于其来源有限，术后并发症多，临床应用有限；异体骨移植虽来源充足，但其外源性易引发机体剧烈的排斥反应，移植成功率低。因此，开发能够弥补上述不足的骨移植材料是当前研究的热点与难点。近些年来，飞速发展的组织工程技术也许有望担当此重任。研究目的本研究以无机的羟基磷灰石与有机的聚己内酯作为原材料，使用快递成型技术中的一种——选择性激光烧结技术构建人工骨支架，并将其与能够持续分泌人骨形态发生蛋白-7的种子细胞相复合，制备出组织工程化纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架，通过对该组织工程化人工骨支架的表征、体外生物相容性、生物活性以及骨缺损修复能力进行检测与分析，证明了组织工程化纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架的临床应用潜力，为其今后在骨缺损治疗中的应用奠定了一定的实验基础。研究方法1.制备纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架：本部分研究以纳米级羟基磷灰石与微米级的聚己内酯为原材料。根据反应方程式（10Ca(NO3)2+6(NH4)2HPO4+8NH3H2O→Ca10(PO4)6(OH)2+20NH4NO3+6H2O）制备得到纳米-羟基磷灰石粉末；通过深温冷冻粉碎技术，制得微米级别的聚己内酯粉末。通过扫描电镜和X线衍射等表征检测，证明所制备的两种粉末材料正是本研究所需的两种物质，同时符合了本研究对原材料粒径大小的需求。使用V型混合机将两种材料的混合粉末混合5min、15min、30min、45min、1h、2h，混合完成后，扫描电镜观察混合的均匀度以确定最佳混合时间。根据最佳混合时间，制备出不同的质量比的纳米-羟基磷灰石与聚己内酯混合粉末。通过对选择性激光烧结机器参数的不断摸索及优化，确定出制备纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架的最优参数。对制备完成的各组支架，经宏观观察、扫描电镜、孔隙率、抗压强度、MTT、ALP染色及茜素红染色等检测，考察各组支架的形态结构、力学强度、生物相容性与生物活性，比较并筛选出综合性能最佳的纳米-羟基磷灰石/聚己内酯支架，以作为后续体内实验的样品。2.制备转基因种子细胞：本部分研究首先从新西兰兔股骨骨髓中分离、提取出骨髓间充质干细胞，并进行培养、传代，传至第3代时即可用作实验。根据GenBank中人骨形态发生蛋白-7（hBMP-7）的基因序列（基因序列号：NM001719），利用基因工程技术，制备出重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP，对该重组腺病毒载体进行酶切与测序验证。将验证正确的重组腺病毒载体进行包装、扩增与纯化，293细胞感染剂量法测定重组腺病毒的滴度。通过体外基因转染的方法将hBMP-7转染到先前制得的兔骨髓间充质干细胞上，得到本研究所需的转基因种子细胞，经RT-PCR、Western blot与钙结节染色，以观察转基因种子细胞在体外环境中目的基因hBMP-7的表达情况及其对骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导作用。3.纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架与转基因种子细胞的复合本部分研究通过建立新西兰兔股骨局部骨缺损及桡骨大段骨缺损模型，将单纯聚己内酯支架、纳米-羟基磷灰石/聚己内酯支架以及纳米-羟基磷灰石/聚己内酯+转基因种子细胞支架分别植入骨缺损部位，通过植入后不同时间点的影像学与组织学检查，以观察并评定各组支架对新西兰兔骨缺损的修复情况，并由此探索纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架与携带有hBMP-7目的基因的种子细胞结合后是否具有协同促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力。研究结果1.羟基磷灰石与聚己内酯粉末的扫描电镜与X线衍射结果显示，所制备的两种材料粉末分别达到了纳米级别与微米级别，同时其与标准样品的符合率均达到了99%以上，表明这两种材料粉末达到了本研究对原材料的要求。V型混合机将两种材料的混合粉末混合5min、15min、30min、45min、1h、2h后的扫描电镜结果表明，1h的混合均匀度与2h相似，但较5min、15min、30min、45min均为高，因此确定，1h为最佳混合时间。将两种材料粉末按照纳米-羟基磷灰石：聚己内酯=0:100、5:95、10:90、15:85、20:80的比例混合，根据摸索与优化出的选择性激光烧结机器参数，以烧结纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架，烧结完成后，人工骨支架的扫描电镜、孔隙率、抗压强度、MTT、ALP染色及茜素红染色等试验结果显示，选择性激光烧结技术所制备出的支架具有相互连通的三维孔隙结构，随着纳米-羟基磷灰石比例的增高，人工骨支架的孔隙率略微随之下降，但力学强度却有着显著提高，达到了7Mp；MTT的结果显示各组人工骨支架均具表现出良好的生物相容性；同时，ALP染色及茜素红染色的染色结果表明含有纳米-羟基磷灰石的组的人工骨支架的生物活性明显优于纯聚己内酯组，且随着纳米-羟基磷灰石含量愈高其生物活性愈强。2.从新西兰兔骨髓中分离、提取出骨髓间充质干细胞，并进行培养、传代，传至第3代时用作实验。利用基因工程技术，成功构建出重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP，酶切测序并验证。结果显示此核酸序列与PUBMED中公布的hBMP7序列(NM-001719)的编码序列100%吻合，证明且插入片段方向正确。梯度稀释重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP感染293细胞，48h后荧光计数法进行病毒感染滴度测算，得到重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP感染滴度约为1.1×1011v.p./ml。使用该重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP转染3代兔骨髓间充质干细胞后第1-3d荧光计数情况。以出现较高的细胞转染效率、较轻微的细胞毒性反应以及较经济的病毒用量为判定标准，确定该重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP转染兔骨髓间充质干细胞的最佳感染复数（MOI）为50:1。选用最佳感染复数（MOI=50:1）感染兔骨髓间充质干细胞。以重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP感染兔骨髓间充质干细胞为实验组，以Ad-CMV-ires-eGFP感染兔骨髓间充质干细胞为对照组，以兔骨髓间充质干细胞不进行处理为空白对照组，连续诱导培养3周。诱导培养期间于第4、7、14、21、28d，hBMP7的PCR实时定量测定与Western blot结果表明：重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP转染兔骨髓间充质干细胞后能够有效介导外源目的基因的表达，且被转染细胞的hBMP7表达在14d时到达高峰，在21d时开始下降。培养期间倒置显微镜下观察到，实验组细胞随着培养时间的延长，逐步出现成骨诱导样形态改变，细胞由纺锤形转变为立方形、多角形，同时有点状钙化斑出现。同时，诱导培养第4、7、14、21、28d的ALP染色、I型胶原PCR实时定量测定、茜素红染色的实验结果显示：实验组的ALP染色阳性强度最高；I型胶原的表达最多；钙结节数量多，形态明显，这亦表明实验组中被转染的兔骨髓间充质干细胞被成功的诱导并开始向成骨细胞方向分化。3.分别建立新西兰兔股骨外上髁处直径6mm，深度10mm的局部骨缺损以及新西兰兔桡骨中段长度为20mm的大段骨缺损模型，并植入相应材料，植入后逐层缝合切口。术后常规肌肉注射抗生素7天。术后1-14天观察显示，各组植入材料区域均无感染现象，各实验动物伤口愈合良好，所有切口Ⅰ级愈合。以上结果表明，植入的材料对实验动物无明显不良影响。术后3w、6w、9w及12w的Micro-CT结果显示，纳米-羟基磷灰石/聚己内酯+转基因种子细胞支架植入组，其骨缺损修复情况较其余3组明显为优，9w时其局部骨缺损包括皮质骨几乎已修复完毕，12w时骨缺损区域生成的新骨结构完整、连续，骨髓腔大部分已通，缺损几乎完全修复。同时植入区域病理切片示，各植入组未见有明显的不良炎症反应和免疫反应，且纳米-羟基磷灰石/聚己内酯+转基因种子细胞支架植入组的新骨生成量明显多于其余各组，且在9w和12w时，植入的材料已经出现较为明显的降解，降解部分多被纤维组织或新生骨所替代。研究结论选择性激光烧结技术作为快速成型技术的一种，能够根据计算机三维模型，进行快速、批量的加工生产，表明其在组织工程，乃至骨科临床领域具有巨大的应用潜力。以纳米-羟基磷灰石与聚己内酯粉末为原材料，通过选择性激光烧结技术所制备出的人工骨支架，经实验证明，具有高度联通的三维孔隙结构，较高的孔隙率，较为优秀的力学强度，同时亦具有出色的生物相容性及生物活性。以腺病毒为载体，将人骨形态发生蛋白-7基因转染进兔骨髓间充质干细胞后，可以明显促进兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向的诱导分化。将纳米-羟基磷灰石/聚己内酯+转基因种子细胞相复合所构建出的组织工程化人工骨支架，较单纯的人工骨支架，具有更为显著的骨缺损修复能力，展现了其在临床骨缺损治疗上广阔的应用前景。