论文部分内容阅读
自VI型分泌系统（T6SS）2006年被发现以来,这十年间它一直作为国内外学者的一个研究热点,而关于肠外致病性大肠杆菌（Ex PEC）的T6SS的研究却并不多。T6SS是一种在效应细胞与靶细胞之间转运蛋白的动态装置,它保守地存在于25%的革兰氏阴性菌中,其中包括铜绿假单胞菌、霍乱弧菌及大肠杆菌等。T6SS还可分泌效应分子靶向竞争细菌及真核细胞,因此其在细菌的致病性中起重要作用。PCN033属猪源肠外致病性大肠杆菌,它分离于2006年高热病病猪脑部,是一株高致病性菌株。通过对其全基因组测序及进一步的序列比对,发现了T6SS基因簇的存在。本研究中以PCN033作为研究对象,探究其T6SS簇内基因PPECC3300229（以下简称0229）的功能。即构建以PCN033为亲本菌株的Δ0229基因缺失株,通过比较其与亲本菌株的生物学特性,探究基因0229的功能。1.Δ0229基因缺失株及Δ0229-0229互补菌株的构建采用的是自杀性质粒p RE112介导的同源重组的方法,首先扩增0229的上下游同源臂。分别将扩增产物连接到穿梭质粒p Bluescript II SK（+）上,酶切回收连接好的同源臂,转而连接至p RE112上构建重组质粒。成功构建的重组质粒转入x7213中,并以其为供体菌,PCN033为受体菌,进行接合转移。经过两次单交换过程,利用蔗糖敏感性及氯霉素抗性,对菌株进行正反筛选,进而得到Δ0229基因缺失株。通过所设计的基因外部及内部的鉴定引物,PCR扩增鉴定,最终确定Δ0229基因缺失株的构建成功。扩增0229基因产物,酶切扩增产物,并将其连入穿梭质粒p HSG396,成功构建的重组质粒电转到Δ0229缺失株,氯霉素抗性平板筛选阳性克隆子,并通过设计的通用引物进行PCR验证,成功获得Δ0229-0229互补菌株。2.细菌间竞争能力相关性的研究以大肠杆菌的K12菌株W3110作为被捕食菌,野生株PCN033,缺失株Δ0229作为捕食菌株,进行种内竞争作用,结果显示,与缺失株Δ0229互作的试验组中,W3110的存活率有明显下降,也就是在基因0229缺失后,菌株的竞争能力增强。表明基因0229可能在细菌间的竞争中起到一定作用。3.致病力相关性的研究小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）作为细胞模型,进行的吞噬后存活试验,分别比较野生株PCN033及缺失株Δ0229被细胞吞噬后,在各时间点的存活率,缺失株在2 h、4 h后相比野生株的存活能力虽有上升,但差异并不具有显著性,而6 h后的结果差异明显。而在以人脑微血管内皮细胞（HBMEC）为细胞模型的粘附侵入试验中,相比于野生株PCN033,缺失株Δ0229试验组的粘附侵入能力显著上升,且互补菌株Δ0229-0229对这种表型的差异有明显的回补效果,结果表明0229可能与PCN033粘附侵入HBMEC,引起脑膜炎相关。以4周龄的雌性昆明鼠作为动物模型,比较野生株PCN033与缺失株Δ0229的组织定殖能力。摘取小鼠的脑、脾、肺及肾组织,并对其中的细菌量进行计数,缺失株Δ0229试验组在各组织中的菌量显著高于野生株PCN033试验组,表明缺失株Δ0229具有更强的组织定殖能力。利用菌株PCN033的本体动物猪的全血,进行全血杀菌试验,比较野生株及缺失株在与全血互作1 h、2 h、3 h后的存活率,结果显示,相对于野生株,缺失株在各个时间点的存活率更高,但经过对数据的分析,该差异不具有显著性。4.荧光定量PCR对T6SS相关基因转录水平的检测荧光定量PCR检测野生株PCN033及缺失株Δ0229中T6SS基因的表达水平,结果显示,缺失株中T6SS的一些基因上调表达。缺失株与野生株在表型上的不同,可能是T6SS相关基因差异性表达的结果。5.0229编码蛋白的原核表达PCR扩增0229目的片段,酶切回收后连入p ET28a表达载体,成功构建重组质粒后,转入E coli/BL21的感受态中进行融合表达,通过SDS-PAGE及Western blot鉴定后,确定aec28蛋白成功表达,但集中表达在包涵体中。