全球能源危机加速了人们对于可再生资源的探寻。木质纤维素作为自然界中含量最丰富、分布最广的可再生资源,在新能源的开发过程中有着巨大的潜力,其中利用纤维素来生产燃料乙醇具有广阔的应用前景,但相对较低的纤维素水解效率仍是限制其实际应用的瓶颈之一。里氏木霉具有强大的纤维素酶分泌能力,是主要的纤维素酶工业生产菌株,同时也是研究纤维素酶表达的模式菌株。里氏木霉中纤维素酶的分泌合成是一个的基因诱导表达过程,不溶性的纤维素及可溶性的纤维寡糖、纤维二糖、乳糖及槐糖等均能诱导纤维素酶的表达。近几十年来,人们在纤维素酶的酶系组成、酶活性质的提升及转录水平的调控等方面进行了深入的研究并取得了一系列成果。然而人们对于纤维素酶表达的起始阶段,里氏木霉如何对诱导物进行感知及起始后续的信号转导过程仍知之甚少,因此系统研究里氏木霉的碳源感应过程对于阐明里氏木霉的纤维素降解机制有着重要的理论意义,也对于里氏木霉的开发利用具有重要的指导意义。真菌细胞对于碳源的感应往往涉及到一些膜受体及相应的胞内信号级联传递途径。在近几年的研究中,人们在里氏木霉中发现了多种参与碳源感应及转运的膜蛋白,其中对纤维素酶表达调控最关键的膜蛋白是Crt 1（Cellulase regulating transporter1）。Crt1是本实验室通过转录组测序筛选鉴定到的膜蛋白,前期的研究发现,crt1缺失后造成了里氏木霉在不同培养条件下纤维素酶表达能力的丧失。进一步的转录分析发现,△crt1菌株在以纤维素为碳源的培养条件下主要纤维素酶基因的转录严重受阻,同时也引起了纤维素酶基因转录激活因子xyr1的转录下调,说明了 Crt1在转录水平上对里氏木霉纤维素酶基因的表达进行了调控。由于Crt1为膜蛋白,其可能参与了对纤维素诱导信号的感应过程。在里氏木霉信号传递途径研究中,丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）不但参与了里氏木霉中压力响应的调控,且研究结果表明,与酿酒酵母Hog1同源的MAPK——Tmk3在纤维素信号的感应过程中可能也具有重要作用:tmk3的缺失在转录水平上引起了纤维素酶基因表达的下调,这也暗示着Tmk3的上游通路可能参与了纤维素酶表达过程中的信号感应。鉴于Crt1在纤维素酶表达过程中的重要性,有必要对其细胞定位及所参与的信号传导途径进行全面解析以阐述纤维素酶基因的诱导表达调控机制。此外,通过对Tmk3上游调控途径的研究能够有助于深入揭示里氏木霉诱导过程中的碳源感应和信号触发机制。因此,我们围绕里氏木霉Crt1及Tmk3的上游信号通路开展了一系列工作,主要取得了以下研究成果:一、确定了 Crt1的细胞定位,发现其在纤维素酶诱导过程中不仅定位于细胞膜,还定位于细胞核膜上。通过对Crt1进行基因座位原位融合GFP编码序列,我们构建了crt1-gfp菌株,对Crt1在不同碳源上的细胞定位进行了荧光检测。研究发现,当菌体在葡萄糖及甘油等非诱导碳源上培养时检测不到Crt1的信号;在木聚糖上培养时Crt1主要定位于细胞膜上;而在纤维素、乳糖、纤维二糖及槐糖等碳源上培养时Crt1定位于细胞膜及胞内未知区域呈“环状”分布,且随着诱导时间的进行胞内定位现象进一步增强。通过免疫金电镜技术对Crt1的亚细胞定位进行了分析,利用扫描电镜对胶体金颗粒的检测证明了 Crt1在胞内形成的“环状”分布区域为细胞核膜,此外,Crt1在细胞质膜及内质网中也有分布。利用分级分离技术,在crt1-gfp菌株以纤维素培养时提取细胞质膜组分、细胞核组分及细胞核外膜组分,进一步证明了 Crt1在上述不同组分中均有分布。此外,在研究过程中我们还发现Crt1在碳源转换过程中能够从细胞膜上转移到细胞核膜上。二、通过对Crt1与胞内不同细胞组分的标记蛋白进行共定位分析,发现了内吞途径、核孔复合物及Sec61复合物参与了其定位形成过程,为后续信号传递途径的解析奠定了基础。在以纤维素为碳源的条件下,对Crt1与胞内不同细胞组分的标记蛋白进行了共定位检测分析。首先在Crt1与转录因子Xyr1的共定位检测中发现,Xyr1定位于Crt1的内部,这不但进一步证实了 Crt1的核膜定位,也说明了两者在定位上的相关性。随后对Crt1与早期内吞体标记蛋白Rab5进行共定位检测,发现Crt1在诱导的中后期能够与Rab5形成共定位,说明了内吞途径在Crt1的定位变化过程中可能发挥一定作用。进一步对控制内吞过程起始的end3基因进行缺失,发现了抑制内吞过程并不改变Crt1的细胞定位,但引起了里氏木霉纤维素酶表达的缺陷。由于Crt1能够定位于细胞核膜上,我们对其与核孔复合物中的Nsp1及Nup205组份进行了共定位分析。结果表明在非诱导状态下,Nsp1及Nup205在核膜上均匀分布,而在诱导状态下随着Crt1的表达,Nsp1及Nup205在核膜上呈不规则分布,说明Crt1-GFP在核膜上与核孔复合物不同的组分之间存在竞争关系,也暗示了核孔复合物有可能参与了Crt1的定位变化及信号传递过程。前期研究表明,内质网Sec61复合物在膜蛋白受体核转移过程中发挥着重要作用。我们进一步对Sec61复合物与Crt1的关系展开了研究,实验结果说明在诱导过程中Sec61α能够与Crt1在内质网和核膜上形成明显的共定位现象,说明其有可能参与Crt1的核膜定位的形成过程。随后我们对sec61 α进行了内源启动子置换,虽然Sec61α表达量的人为改变导致菌体生长缺陷,但我们发现sec61α受到表达抑制时,里氏木霉无法表达纤维素酶,同时Crt1的细胞核定位也无法形成,说明Sec61α对纤维素酶的表达及Crtl定位的重要性。与sec61α相比,sec61β亚基的缺失并不影响菌株生长及Crt1在纤维素下的定位均不受影响,然而胞外的纤维素酶酶活却下降了约60%,说明了 Sec61β在功能上虽然不如Sec61α重要,但也参与了纤维素酶的表达调控过程。最后,我们通过Co-IP实验钓取了可能与Crt1相互作用的蛋白,为进一步探讨Crtl的功能奠定了基础。三、通过对Crt1功能区域及自身转录调控分析,发现了其C端及N端结构域对于功能发挥是必要的,阐明了在纤维素酶诱导过程中Xyr1与Crt1之间的调控关系,找到了参与crt1基因转录的多个调控因子。通过在野生型菌株中对Crt1的C端进行缺失,发现C端缺失突变体与crt1缺失菌表型一致,二者均不能够利用纤维素,说明了Crt1的C端在其功能发挥过程中的重要性。随后通过在△crt1菌株中原位回补C端缺失突变体、N端缺失突变体及C端赖氨酸突变的突变体,进一步证明了 Crt1的N端、C端及C端的赖氨酸在其功能行使中是必需的。在研究过程中我们也发现,由于突变体活性的丧失引起了 crt1启动子无法引起突变体基因的转录,说明了crt1自身也受到纤维素的诱导调节,而利用异源启动子无法实现对Crt1及其突变体的成功表达则暗示crt1可能存在转录后或者翻译水平上的修饰。由于Xyr1在纤维素酶基因表达中的关键作用以及Crt1与Xyr1的共定位关系,我们进一步分析了 Xyr1对crt1自身转录过程的控制。与其他大部分纤维素酶基因的表达一致,在xyr1缺失条件下,crt1无法进行转录;在非诱导条件下对xyr1进行过表达,虽然纤维素酶基因的转录显著提升,却检测不到crt1的转录,说明了 Xyr1的表达是Crt1表达的必要非充分条件,而过表达Xyr1可以回补△crt1菌株纤维素利用缺陷的表型,进一步说明在纤维素酶基因表达过程中Xyr1处于Crt1信号途径的下游。最后我们利用crt1启动子进行了酵母单杂交筛选,筛选到了几个可以结合crt1启动子的目标蛋白,其中Tr108357及Rce1可能对crt1的转录调控起着重要作用。四、对里氏木霉Hog1类型的MAPK上游途径进行了鉴定和功能分析,证明了Sho1支路及Sln1支路在纤维素酶表达调控中发挥相反的作用。通过生物信息学分析鉴定了 Hog1同源蛋白Tmk3上游的两条调控通路:Sho1支路及Sln1支路。通过对两条信号途径中不同组分的缺失及过表达,发现在Sho1支路中,Trste20的缺失引起了菌体在不同碳源上生长的缺陷,同时引起了菌体对高渗压力抗性的降低,而Trsha1则在压力响应及细胞壁完整性的维持上发挥负调控作用。在Sln1支路中,Trypd1的缺失引起了菌体生长的严重缺陷及对不同压力的敏感性增强,同时菌体的细胞壁完整遭到破坏。除此之外,Sho1支路及Sln1支路在里氏木霉纤维素酶表达过程中均发挥调节作用,其中Sho1支路发挥正调控作用,而Sln1支路则发挥负调控作用:Trste20或者Trsho1的缺失均引起了里氏木霉在纤维素诱导条件下纤维素酶基因转录的严重下调,而Trypd1的缺失没有对纤维素酶的表达造成影响,反而过表达Trypd1降低了纤维素酶基因的转录。对于这两条支路在压力响应及纤维素酶表达调控中作用的研究也证明了在对于不同信号的感应及传递过程中存在着交叉现象。