抗菌肽（AMPs）,一种小分子多肽,其N端含有Pro。水产类来源的生物生活环境复杂,易遭受各种病原微生物的侵染,并且它们本身没有特异性免疫功能,因此天然免疫是它们抵抗来自病原微生物的侵害的重要途径。微生物侵染宿主后,宿主会启动天然免疫,从而为宿主启动获得性免疫提供充足的时间。c型溶菌酶、防御素均属于水产类动物体液免疫中的有效成分,具有抗菌、抗病毒等功效。目前,抗生素和防腐剂起着重大作用,特别是在水产养殖和加工领域。为了提高水产品的质量及经济效益,有学者把目光放在了天然抗菌肽和防腐剂上,如可用其代替抗生素的使用则有重大的意义。但是直接从组织中提取和纯化抗菌肽的操作复杂、产量低、花费多,而且其体内含量极低。生产规模小也是抗菌肽实现实用的一大妨碍。本研究主要开展了基于重组毕赤酵母的鲫鱼（Carassius auratus）c型溶菌酶生物合成及其特性以及基于两种甲壳类动物抗菌肽基因的重组菌株X-33/pPICZαA-PC的构建。本研究第一阶段聚焦于鲫鱼c型溶菌酶在毕赤酵母中的重组表达及其抑菌活性和稳定的检测。c型溶菌酶是鲫鱼先天性免疫机制中的关键性免疫蛋白。本研究通过反转录PCR（reverse transcription PCR,RT-PCR）克隆编码鲫鱼c型溶菌酶的cDNA,再经三次PCR获得5’端含XhoI限制性位点、Kex2信号肽酶切割位点和6×His标签以及3’端含终止密码子和XbaI限制性位点的目的基因“CrCLm”。以pPICZaA为表达载体、毕赤酵母（Pichiapastoris）X-33为工程菌,构建重组菌株 X-33/pPICZaA-CrCLm;在 28℃、250r/min、初始 pH6.0、1.0%甲醇诱导的条件下表达96 h;表达产物经固化金属离子亲和层析进行纯化,纯化产物用于Western blot分析和LC-MS/MS质谱鉴定。另一方面,对该重组菌株产物的抑菌活性和稳定性进行考察。结果表明:在上述发酵培养条件下,获得产量为18.3 mg/L的重组蛋白,经纯化后的结构鉴定证明其为预期的分子量14.5 kD的重组CrCLm。抑菌试验结果显示:重组蛋白CrCLm对革兰氏阳性的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisi）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）以及革兰氏阴性的大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）具有明显的抑菌活性;pH变化和高温环境并不影响其抑菌活性;此外,重组CrCLm对胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K的水解具有良好的耐受能力。本研究的第二阶段聚焦于一种杂合类抗菌肽的毕赤酵母表达系统构建。防御素是一类阳离子抗菌肽,具有抗菌谱广的特点,其在大多数鱼贝类的天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用。本研究以已有的三疣梭子蟹C型溶菌酶成熟肽基因（ptlyC）和太平洋牡蛎大防御素成熟肽基因（CgD）为模板,通过一个含4个甘氨酸（4×Gly）和肠激酶酶切位点（DDDDK）的编码序列,经SOE-PCR将ptlyC与CgD串联获得融合基因ptlyC-CgD,随后与表达载体pPICZαA连接,即pPICZαA-ptlyC-CgD重组融合表达载体;通过电穿孔将其电转至毕赤酵母X-33中,经筛选验证成功构建了重组菌株X-33/pPICZαA-ptlyC-CgD。本研究构建的重组毕赤酵母菌株能有效合成具有良好的抑菌活性和稳定性的鲫鱼c型溶菌酶,并对其表达条件进行了优化;其次还成功构建了两种甲壳类动物抗菌肽基因的融合表达载体,为其以后的研究和大规模制备提供了重组DNA技术。