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目的阿片类镇痛药物是手术麻醉及中重度疼痛治疗的首选,但其存在致痛觉过敏、耐药性和成瘾性的副作用。这些副作用的产生被证明由脑内胶质细胞激活后释放的过量炎症因子等介导。阿片药物通过与神经元细胞表面的阿片μ受体和κ受体结合发挥镇痛作用,而以往研究认为阿片药物对胶质细胞的激活及胶质细胞对阿片耐受的产生是由μ受体介导的。不同阿片类药对胶质细胞的激活作用及机制尚有待于进一步阐明。此外,已有研究表明多种炎症性和退行性神经系统疾病中都有胶质细胞的激活及胞内转运蛋白(Translocator protein,TSPO)的高表达,而应用TSPO配体可抑制胶质细胞的激活。但TSPO是否参与阿片药物对胶质细胞的激活及使之产生阿片耐受过程尚不明。本研究旨在1分析不同阿片药物对小胶质细胞激活的影响,并阐明这一过程是否有κ受体参与;2研究TSPO是否参与阿片药物对胶质细胞的激活及胶质细胞介导的阿片耐受,以及作为TSPO配体的苯二氮卓类镇静药咪达唑仑是否可以缓解阿片类镇痛药对胶质细胞激活及阿片耐受副作用的产生。本研究通细胞及动物模型水平的研究为临床麻醉联合用药提供更为科学合理的方案和基础依据。方法1分析对阿片μ和κ受体都激活的阿片类药物对小鼠小胶质细胞系BV2细胞的激活效果。经培养基分别给予BV2细胞等效临床剂量的吗啡5μM,羟考酮5μM,吗啡酮1μM,芬太尼0.03μM,舒芬太尼0.003μM,继续培养24 h后提取各组总RNA,RT-q PCR法检测炎性细胞因子TNF-α(Tumor necrosis factor–α,肿瘤坏死因子–α)、IL-6(Interleukin-6,白介素-6)、IL-1β(Interleukin-1β,白介素-1β)的m RNA水平。2分析阿片受体部分激动剂地佐辛(激动κ受体的同时却拮抗μ受体)对BV2细胞的激活效果,并分析非选择性阿片受体拮抗剂纳洛酮(同时拮抗μ和κ受体)对地佐辛的拮抗作用。经培养基分别给予BV2细胞不同浓度的地佐辛(4μM,40μM,400μM);不同浓度的纳洛酮(0.1μM,1μM,10μM);地佐辛+纳洛酮(4μM+0.1μM,40μM+1μM,400μM+10μM);孵育24 h后,提取各组总RNA,RT-q PCR法检测各组TNF-α、IL-6、IL-1β的m RNA水平。3经培养基分别给予BV2细胞不同浓度(1μM,5μM,25μM,100μM)的吗啡处理24 h,以及经培养基分别给予吗啡25μM孵育不同时间(6 h,12 h,24 h,48 h,72 h)后,提取各组总RNA,RT-q PCR法检测各组TNF-α、IL-6、IL-1β的m RNA水平。4分析咪达唑仑对吗啡激活BV2细胞的影响。经培养基别给予BV2细胞咪达唑仑5μM、吗啡25μM、咪达唑仑5μM+吗啡25μM,处理24 h后提取各组总RNA,RT-q PCR法检测各组TNF-α、IL-6、IL-1β、TSPO的m RNA水平;提取各组总蛋白,Western blot法检测小胶质细胞激活标记物Iba1(Ion calcium adaptor protein 1,离子钙接头蛋白1)和TSPO的蛋白水平。5用TSPO si RNA转染BV2细胞24 h后,分别给予咪达唑仑5μM、吗啡25μM、咪达唑仑5μM+吗啡25μM,处理24 h后RT-q PCR法检测TNF-α、IL-6、IL-1β的m RNA水平;Western blot检测Iba1的蛋白水平。6吗啡急慢性耐受大鼠模型均取正常雄性SD大鼠四组每组6只,分别给予吗啡10 mg/kg、咪达唑仑0.5 mg/kg、咪达唑仑0.5 mg/kg+吗啡10 mg/kg及等体积生理盐水。大鼠急性耐受模型每两小时给药一次,共7次,大鼠慢性模型于每日给药两次,共7 d。每次给药15 min后用热甩尾法检测各组大鼠疼痛阈值变化。急慢性模型均于次晨第8次给药后处死并取中脑组织,RT-q PCR法检测TSPO的m RNA水平,免疫组化观察中脑导水管周围灰质Iba1、TSPO和GFAP(glial fibrillary acidic protein,胶质细胞原纤维酸性蛋白)的蛋白表达变化。结果1等效临床剂量的吗啡、羟考酮、吗啡酮、芬太尼及舒芬太尼均可以上调BV2细胞中TNF-α、IL-6及IL-1β的m RNA水平(P<0.05)。2 10倍临床剂量的地佐辛可以引起BV2细胞TNF-α、IL-6及IL-1βm RNA水平上调(P<0.05),纳洛酮单独给药对BV2细胞TNF-α、IL-6及IL-1βm RNA水平无影响(P<0.05)。但纳洛酮可以抑制地佐辛对对BV2细胞TNF-α、IL-6及IL-1βm RNA的上调作用(P<0.05)。3吗啡对BV2细胞TNF-α、IL-6及IL-1β的m RNA的上调作用呈时间和剂量依赖性。4等效临床剂量咪达唑仑对BV2细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β及TSPO表达均无影响(P>0.05)。但与吗啡组相比,咪达唑仑和吗啡联合用药组中TNF-α、IL-6、IL-1β及TSPO的m RNA水平显著下调(P<0.05),TSPO及Iba1的蛋白水平显著下调(P<0.05)。5敲低TSPO后,吗啡对小胶质细胞的激活作用未受影响,而咪达唑仑和吗啡联合用药组中TNF-α、IL-6、IL-1β的m RNA及Iba1蛋白水平显著低于吗啡组(P<0.05)。6吗啡急性耐受模型在第五次注药后,咪达唑仑明显抑制了多次注射吗啡导致的痛阈下降(P<0.05);咪达唑仑显著抑制了(P<0.05)吗啡对TSPO m RNA的上调作用(P<0.05);免疫组化显示,咪达唑仑明显抑制(P<0.05)吗啡引起的Iba1和TSPO蛋白水平的上调(P<0.05)。吗啡慢性耐受模型在第4天给药后,咪达唑仑明显抑制了多次注射吗啡导致的痛阈下降(P<0.05);咪达唑仑显著抑制了(P<0.05)吗啡对TSPO m RNA的上调作用(P<0.05);免疫组化显示,咪达唑明显抑制了(P<0.05)吗啡引起的GFAP和TSPO蛋白水平的上调(P<0.05)。结论1等效临床剂量的阿片药物能诱导小胶质细胞激活并促进炎性因子表达。2阿片药物激活小胶质细胞不仅有μ受体介导,κ受体也参与其中。3吗啡对小胶质细胞的激活呈时间和剂量依赖。4咪达唑仑本身不引起小胶质细胞变化,但却可以抑制吗啡引起的小胶质细胞激活,并下调TSPO的表达。5 TSPO不介导吗啡对小胶质细胞的激活过程,但它是介导咪达唑仑抑制吗啡对小胶质细胞激活作用的因素之一。6体内实验同样证实,咪达唑仑同吗啡联合给药抑制了急慢性吗啡耐受模型大鼠中脑导水管周围灰质区的小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,抑制TSPO的表达的上调,并延迟热痛耐受的时间。