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葡萄扦插技术不能获得大量的脱毒苗,传统的育种技术很难获得抗病葡萄品种,组织培养技术对葡萄无病毒株系的建立和转基因葡萄育种的研究提供了技术支持。而葡萄转基因工程目前发展的瓶颈是葡萄再生频率低,转化率低。本研究以原产于贵州葡萄属野生种毛葡萄、刺葡萄和腺枝葡萄的单芽茎段、叶片、叶柄和不带芽茎段为试材,利用均匀设计进行快速繁殖和离体再生,并对影响快繁和再生的不同因素进行了研究,以建立贵州葡萄属野生种离体快繁和再生的技术体系,为野生材料的大量繁殖、离体保存提供技术和材料支撑,为葡萄遗传转化奠定理论和技术基础。主要取得了以下研究结果: 1.葡萄属野生种无菌系建立 4-6月取毛葡萄新梢,消毒8min后接种在MS+BA2.0mg?L-1+IBA0.2mg?L-1培养基上适宜诱导腋芽萌发及继代培养,诱导率可达47.1%;刺葡萄的腋芽诱导适宜培养基为B5+ZT1.0mg?L-1+NAA0.01mg?L-1(诱导率达95.6%);诱导腺枝葡萄腋芽萌发的适宜培养基为MS+BA1.0mg?L-1+NAA0.2mg?L-1,诱导率可达50.0%。 成熟的毛葡萄种子经10%浓H2SO4浸泡10min后培养在1/2MS+IBA0.8mg?L-1上培养效果好(萌芽率100%),而腺枝葡萄种子需经过98%浓H2SO4浸泡30min后培养在1/2MS+BA0.2mg?L-1+GA0.3mg?L-1+IBA0.8mg?L-1上效果较好。 2.葡萄属野生种快速繁殖体系的建立 毛葡萄不同单株单芽外植体增殖和生根需要的培养条件存在差异,增殖培养基均为附加不同浓度BA和IBA的MS培养基,生根培养基为附加不同浓度IBA和IAA的1/2MS培养基。其中‘花溪-4’增殖培养基为MS+BA2.0mg?L-1+IBA0.07mg?L-1,增殖率是100%,繁殖系数是19.7,生根培养基为1/2MS+IBA0.15mg?L-1+IAA0.20mg?L-1,生根率达100.0%。 3.葡萄属野生种再生体系的建立 以毛葡萄试管苗的无芽茎段(带叶叶柄)为材料,切成0.5cm小段接种在培养基中,茎段培养在MS+BA3.0~3.5mg?L-1+IBA0.1mg?L-1或MS+BA1.0mg?L-1+KT2.8mg?L-1+IBA0.01mg?L-1上易诱导愈伤组织,诱导率为100.0%,培养在MS+BA2.5mg?L-1+KT0.0001mg?L-1上愈伤组织增殖和分化效果好,其增殖率为100.0%,分化率达到62.9%;叶柄培养在MS+BA2.5mg?L-1+KT0.16mg?L-1上易诱导直接再生不定芽,再生率达到77.5%,培养在1/2MS+IBA0.19mg?L-1+IAA0.70mg?L-1上诱导直接再生根效果好,生根率为85.7%; 切取毛葡萄再生不定芽的单芽外植体培养在1/2MS+BA0.2mg?L-1+IBA0.2mg?L-1+IAA0.6mg?L-1上继代培养效果好,腋芽增殖率达97.5%,繁殖系数为12.6;培养在1/2MS+IBA0.08mg?L-1+IAA0.14mg?L-1上易诱导再生芽生根成苗,其生根率达100.0%。 将毛葡萄叶片切成0.5cm×0.5cm方块,且垂直主脉方向用刀片划三刀比不经过刀片处理的叶片愈伤组织诱导增殖与分化效果好,带叶叶柄比不带叶叶柄更利于促进再生。 研究中还发现MS培养基利于诱导毛葡萄不定芽再生,不同浓度的植物生长调节剂BA、KT和IBA组合利于促进毛葡萄叶柄和茎段再生,而BA、IBA、IAA与一定浓度的蔗糖组合利于促进毛葡萄叶片再生,本研究中毛葡萄单株‘花溪-4’叶片直接再生率最高达93.3%,获得了高效叶盘再生体系,为今后的转基因工作奠定基础具有重要意义。