目的:　　胆囊癌（Gallbladder carcinoma，GBC）是胆道系统中最常见的恶性肿瘤之一，它具有早期诊断困难、恶性程度极高、预后差等临床特点。通常胆囊癌患者的5年和3年生存率分别约为5%和30%。当前，随着胆道外科手术技术及生物免疫治疗手段的不断发展，临床预后有一定改善。但是胆囊癌通常起病隐匿，大部分胆囊癌患者在初次就诊时就已至临床晚期，失去了手术治疗的宝贵机会，加之胆囊癌对目前已有的非手术治疗方法敏感性不高，这些因素使得胆囊癌患者预后仍然较差。因此阐明胆囊癌发生、进展的分子机制，进而寻找肿瘤相关标志物和干预靶点是攻克胆囊癌，改善胆囊癌患者预后的关键问题之一。　　肝激酶B1（Liver kinase B1，LKB1）具有调控细胞生长、分化、凋亡、细胞极性和能量代谢等作用，也是维持细胞代谢和能量稳态所必需的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的主要上游激酶。LKB1的缺失与恶性肿瘤细胞生长、侵袭、转移和肿瘤干细胞（Cancer stem cells，CSCs）的分化、增殖关系密切。多项研究发现LKB1的缺失存在于人体多种恶性肿瘤中，原因可能是LKB1的缺失造成了下游某些细胞信号通路的异常激活，进而引起恶性肿瘤的发生、发展。由于其涉及多条肿瘤相关细胞信号转导通路，LKB1对细胞信号通路的影响还存在诸多未知之处。深入研究LKB1调控肿瘤细胞增殖、转移的分子机制，可能为胆囊癌治疗提供新的思路。　　许多研究已经证明肿瘤干细胞存在于多种恶性肿瘤中。同样在胆囊癌中也存在着这样一群具备自我分化和更新能力，高度增殖、侵袭能力和致瘤能力的亚细胞群即胆囊癌干细胞。它参与了胆囊癌的发生、发展，并有利于肿瘤的生长、转移和耐药。深入研究胆囊癌干细胞的调控机制有望为胆囊癌的治疗提供新的治疗方向。在本项研究中，会分析LKB1在CD44+和CD133+的胆囊癌细胞亚群中的表达水平，并将对比过表达LKB1的胆囊癌细胞系与对照组细胞的成球能力，揭示LKB1对胆囊癌干细胞的调控作用。　　越来越多的实验表明，JAK酪氨酸蛋白激酶-信号转导和转录激活因子（JAK-STAT）信号转导通路在细胞生长、代谢、凋亡等多个过程中发挥重要作用。在正常细胞中，该信号转导通路受到严密调控，而当该通路的异常激活时可导致肿瘤的发生、发展。其中STAT5、STAT3是信号转导通路中的关键因子，参与多种恶性肿瘤发生、发展。前期工作研究发现LKB1对JAK-STAT信号通路可能存在调控作用，在本研究进一步探讨LKB1对该信号通路的影响。　　根治性手术切除仍是当前胆囊癌唯一可能被治愈的治疗手段，但胆囊癌患者多数确诊时已至晚期，仅有小部分患者存在手术机会。所以积极寻找切实有效的非手术治疗手段对胆囊癌的治疗和改善预后具有重要意义。LKB1作为重要的抑癌基因，对胆囊癌和胆囊癌干细胞的调控机制研究甚少。在前期研究工作的基础上，在本次研究中利用已建立的胆囊癌临床资料数据库（157例患者），首先探讨LKB1在胆囊癌组织及癌旁组织中的表达水平，并进一步分析LKB1表达水平与患者临床预后之间的相关性；然后研究过表达LKB1对胆囊癌细胞系增殖、迁移、侵袭和转移等生物学特性的影响，最后研究胆囊癌肿瘤干细胞中LKB1表达水平及LKB1对JAK-STAT3信号通路的调控作用。　　方法:　　1、通过RT-PCR、免疫组织化学、Western-blot等经典分子生物学方法，检测胆囊癌标本组织及癌旁组织中LKB1的表达水平，并运用统计学方法分析LKB1表达水平与患者临床预后之间的相关性。　　2、利用慢病毒系统构建过表达LKB1的SGC—996和GBC-SD胆囊癌细胞系及对照细胞系并进行验证。　　3、采用CCK-8法、Edu免疫荧光法、Transwell细胞侵袭、迁移实验和克隆形成实验，观察过表达LKB1的SGC—996和GBC-SD胆囊癌细胞和对照组细胞在增殖、迁移、侵袭、转移等生物学行为上的差异。　　4、应用成球实验、流式细胞分析等实验方法观察过表达LKB1胆囊癌细胞系中肿瘤干细胞的变化情况。　　5、将过表达LKB1的SGC—996和GBC-SD胆囊癌细胞及对照组细胞系接种于低粘附的96孔板中，再通过有限稀释实验，观察LKB1对胆囊癌干细胞的影响作用。　　6、采用Western-blot法探讨LKB1对JAK/STAT3信号转导通路的调控作用。　　结果:　　1、通过检测胆囊癌组织中LKB1mRNA和蛋白表达。发现与癌旁组织相比，82.5％（33/40）的癌组织中LKB1mRNA表达显著降低，7例胆囊癌标本组织中观察到LKB1mRNA表达增加。Western-blot电泳的结果显示肿瘤组织中LKB1表达的下调，而在癌旁组织中的表达上调。组织水平上，免疫组织化学结果也证实了胆囊癌中存在LKB1的表达下降。　　2、依据高于或者低于中位数的LKB1mRNA表达水平，将105例GBC患者分为“高LKB1表达组”（n=52）和“低LKB1”表达组（n=53）。“低LKB1”表达组的生存时间短于“高LKB1”表达组。　　3、通过CCK-8法、Edu免疫荧光法、克隆形成实验发现，与对照细胞系相比，过表达LKB1的SGC—996和GBC-SD胆囊癌细胞系生长、增殖能力明显减弱。　　4、通过Transwell迁移、侵袭实验方法发现，过表达LKB1的SGC—996和GBC-SD胆囊癌细胞系侵袭、迁移能力明显减弱。　　5、通过Spheroid成球实验、有限稀释实验发现过表达LKB1后胆囊癌干细胞自我更新能力明显减弱。　　6、利用Western-blot检测,分析LKB1在JAK/STAT3信号转导通路中起到的调控作用。　　结论：　　本课题研究发现LKB1在胆囊癌组织呈现低表达，并与胆囊癌患者临床预后欠佳有明显相关性。LKB1过表达会抑制胆囊癌细胞增殖、迁移、侵袭潜能。LKB1可能通过JAK/STAT3通路抑制胆囊癌细胞的生长、转移和自我更新能力。LKB1可能成为胆囊癌治疗的潜在靶点和预后评价标志物。