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冬虫夏草是我国传统的珍稀名贵中药,由冬虫夏草菌侵染青藏高原高寒草甸中的蝙蝠蛾幼虫而形成的菌虫复合体。由于青藏高原不同地域间气候和地形的多样性,以及寄主昆虫丰富的物种多样性使冬虫夏草菌成为研究真菌进化的理想材料。在真核细胞中,线粒体作为一种重要的细胞器,是研究物种起源与进化的有力工具;线粒体基因结构和组成保守,突变率低,且进化速度快,是一种理想的群体遗传学和进化的分子标记。到目前为止,NCBI网站已公布了约180种真菌的线粒体基因组全序列,但尚无冬虫夏草菌的线粒体基因组序列的报道。本文选取了冬虫夏草菌单子囊孢子菌株XZ08-51-18,参考发表的冬虫夏草菌基因组数据(菌株CO18)中的线粒体DNA序列片段,通过多次PCR拼接成XZ08-51-18完整的线粒体基因组。XZ08-51-18线粒体基因组全长为157,559 bp,在目前已测序真菌中,只有担子菌Rhizoctonia solani(235,849 bp)和子囊菌Sclerotinia borealis(203,051 bp)的线粒体基因组比冬虫夏草菌大。冬虫夏草菌的线粒体基因组包含14个常见的蛋白编码基因(PCG),分别是细胞色素C氧化酶的3个亚基(cox1,cox2,cox3),ATP合成酶的3个亚基(atp6,atp8,atp9)和细胞色素b基因(cob),以及NADH-脱氢酶复合体的7个亚基(nad1,nad2,nad3,nad4,nad4L,nad5,nad6);2个核糖体RNA基因(rRNA),包括核糖体大亚基(rnl)和核糖体小亚基(rns);27个转移RNA基因(tRNA)。整个线粒体基因组中含有54个内含子,内含子的开放阅读框(ORF)主要编码一些归巢内切酶GIY-YIG和LAGLIDADG以及4个逆转录酶,1个核糖体蛋白,3个未知功能的蛋白。内含子和基因间区占整个基因组的86%左右。通过冬虫夏草菌与其他真菌之间的比较可知,冬虫夏草菌是肉座菌目真菌中线粒体基因组最大的真菌;PCG基因和rRNA基因排列顺序、数目基本一致,tRNA基因在线粒体基因组中通常存在3处常见的插入位置,分别是rnl/nad2,rns/cox3和nad6/rnl之间。内含子的比较进一步说明冬虫夏草菌线粒体基因组长度与内含子有很大的关系;系谱分析,支持利用线粒体可以得出和之前利用核基因同样的结果,即传统的虫草类真菌可分成不同的科属。为了分析冬虫夏草菌种内线粒体DNA的分化,我们选择8株不同地理位置的冬虫夏草菌株进行基因组重测序,然后参考XZ08-51-18的线粒体基因组序列,拼接不同冬虫夏草菌株的线粒体基因组。对于存在的gap或序列不确定的地方通过设计引物、PCR扩增和测序等步骤得到其序列,最终组装出完整的线粒体基因组序列。然后,进行基因注释分析,比较所有测得的9株不同冬虫夏草菌株的线粒体基因组组织结构、排列方式、碱基变异情况等。结果表明,冬虫夏草菌线粒体基因组都含有14个PCG基因、2个rRNA基因、25-27个tRNA基因。PCG基因和rRNA基因按照一定的顺序排列依次是rnl-nad2-atp9-cox2-nad4L-nad5-cob-cox1-nad1-nad4-atp8-atp6-rns-cox3-nad6排列。nad2、nad3直接相连,nad4L、nad5之间存在碱基A的重叠。对得到的9株冬虫夏草菌线粒体基因组序列比较可知,冬虫夏草菌线粒体基因组基本相似,但长度存在差异,根本原因在于某些基因中内含子的插入以及基因间区不同长度序列的插入导致。电泳验证菌株间序列差异较大的几个位点,筛选出冬虫夏草菌更加高效的分子标记基因分别是rnl-i5、rnl-E2、cox1-i5、cob-E6、rns-E1、nad2-i3、cox2-i5、rnl-E5、rnl-i6处。选用14个蛋白编码基因保守的外显子序列,进行系统发育分析,结果显示不同菌株间的聚类关系与冬虫夏草菌多基因分析中进化分支有一定的相关性,但不是完全匹配。本文主要报道冬虫夏草菌的线粒体基因组序列,为种内线粒体基因组研究提供了参考。扩增其他不同来源冬虫夏草菌株的线粒体基因组序列,应用比较线粒体基因组学的方法,对不同冬虫夏草菌株,以及冬虫夏草菌与其他真菌进行比较线粒体基因组学研究,筛选冬虫夏草菌更加高效的分子标记基因,有助于增加对真菌线粒体DNA进化规律的认识。研究冬虫夏草菌的进化对于了解冬虫夏草菌的起源和传播方式,以及制定冬虫夏草野生资源保护措施具有重要的意义。