论文部分内容阅读
HCV感染呈全球性分布，以不发达国家感染率为高，我国约为3％，该病原常可引起持续感染，且与肝硬化及肝癌发生率明显相关，是当前严重危害人类健康的重要传染病。由于其体外培养尚未成功，至今尚无满意的感染模型，因而极大的限制了HCV的研究及丙型肝炎的防治工作。迄今为止尚无有效的治疗策略。所以，寻找新的抗病毒策略，预防和清除HCV持续感染很有必要。基因治疗作为一种新型的治疗策略对HCV感染防治具有重要的意义，近年来得到国内外学者广泛认同的策略主要包括反义核酸策略、核酶策略、细胞内干扰性多肽或蛋白策略、抑制性RNA策略等。 HCV为一单股正链RNA病毒，属于黄病毒属嗜肝病毒科。HCV基因含一长的5′UTR，内含多个起始密码子(AUGs)，具特异的二级结构，该结构同脊髓灰质炎病毒(PV)和脑心肌炎病毒(EMCV)的核糖体内部进入位点(IRES)相似。IRES作为HCV基因表达和复制的关键结构成为基因治疗的靶位点之一。IRNA为Coward和Dasgupta在研究PV时，偶然发现的一段60nt的核酸片段，对PV病毒的复制和表达具有较强的抑制作用。为此，探讨IRNA在体内外对HCV基因表达的抑制作用，对HCV感染的防治具有重要的现实意义。 本研究应用分子克隆技术，构建了将具自剪切作用的顺式核酶序列引入IRNA序列两端可保持IRNA一级和二级结构完整性的原核及真核表达体，并以此为基础对IRNA在体外无细胞翻译体系中对HCV IRES介导非帽结构依赖 第四军医大学博士学位论文性蛋白翻译的抑制作用进行了研究。此外，应用脂质体细胞转染方法及新霉素抗性筛选建立了表达IRNA及mIRNA的HHCC细胞，并应用相同方法建立了含HCV IRES的HCV复制子。在此基础上探讨了 IRNA在细胞内瞬时表达及长期表达对HCV IRES介导蛋白表达的抑制作用。最后，我们应用PV疫苗株感染 IRNA表达细胞，并对其病毒致细胞病变效应及病毒滴度进行了滴定。此外，我们还初步探讨了IRNA抑制HCV IRES介导蛋白翻译作用机理。 结果如下： 1．构建了ICh及W原核表达载体地读m认证论同mM及到较前撤然 PcRz－IRNA／PcRz－mIRNA，于目标序歹两端引入具自剪切作用的顺式 核酶序列。 2．将pGRz－IRNA及pGRz－mIRNA体夕转录体与含HCV IRES完整结构的 双顺反子对70C卜34和单顺反子…W讹RIUc体外转录体在免网状 红细胞无细胞翻译体系中进行体外蛋白翻译，证实IRNA／。IRNA在体 外对 HCV RES介导蛋白翻译具抑制作用。 3．PCRZIRNA与含 HCV IRES的 PCM’VNCRlll。共转染 HHCC细胞后，表现出 明显的抑制荧光素酶表达作用：pCRZIRNA转染含HCV IRES的HCV 复制于也表现出一定的细胞内抑制HCV IRES介导蛋白翻译的作用。 HCV IRES介导蛋白翻译作用在IRNA表达细胞中也受到明显抑制。 4．脊髓灰质炎病毒在IRNA表达细胞内的增殖受到明显抑制。 5．IRNA对 HCV 5’UTR与细胞性蛋白多肽的结合作用具有明显的竞争抑 制作用。