论文部分内容阅读
目的探讨不同粒径脱矿骨基质(demineralized bone matrix,DBM)在γ辐照中对胶原结构的影响以及辐照保护剂对保护DBM的有效性。方法取同一供体的冻干皮质骨,皮质骨由冷冻粉碎机粉碎后经泰勒标准筛网筛选出4组粒径皮质骨骨粒:0.5~1.0mm组骨粒;1.2~2.8mm组骨粒;3.3~4.7mm组骨粒;5.7~7.0mm组骨粒。依据Urist改良法,使用梯度乙醇对骨粒进行脱脂,0.6mol/L盐酸对骨粒脱钙处理,并调节p H值后冷冻干燥真空封存。使用索氏提取法对DBM样品脂残余含量测量,原子吸收光谱仪测定DBM样品钙残余含量,并测定其p H值。按照不同γ辐照剂量0k Gy、15k Gy、25k Gy、25k Gy(保护剂)进行辐照处理后储存于-80℃冰箱待检测。辐照后通过扫描电子显微镜观察胶原表面形态,以胶原结构紊乱、纤维束断裂等标志对比胶原表面结构损伤的程度;将样品按照0.2g/ml生理盐水比例在50℃条件下浸泡72h,利用浸提液颜色深度观察胶原被辐照损伤的程度;使用2,4-二硝基苯肼对羰基化合物进行痕量测定(吸光光度计法);十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺钠凝胶电泳法(Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)测定样品中胶原分子量的变化;利用差示热量扫描法(differential scanning calorimetry,DSC)检测样品热变性温度以观察胶原热稳定性。结果经原子吸收光谱仪测定,DBM样品钙含量分别为:1.906±0.468%(0.5~1.0mm),1.940±0.370%(1.2~2.8mm),2.090±0.393%(3.3~4.7mm),2.490±0.252%(5.7~7.0mm);四组之间无统计学差异(F=1.497,P=0.939)。经索氏提取法测定残余脂含量为0.963±0.132%(0.5~1.0mm),0.963±0.036%(1.2~2.8mm),0.946±0.085%(3.3~4.7mm),0.976±0.137%(5.7~7.0mm);四组之间无统计学差异(F=0.082,P=0.969)。所有样品p H值均符合规定范围(5.8~7.5)。样品浸提液颜色与γ辐照剂量相关度较高,未辐照样品浸提液颜色清亮,而在同粒径下随辐照剂量加大浸提液黄色逐渐加深,5.7~7.0mm粒径组颜色相对较浅;25k Gy相比于25k Gy(辐照保护剂)浸提液颜色加深。扫描电镜观察到γ辐照导致胶原结构紊乱,纤维断裂,0~25k Gy范围内当辐照剂量增大胶原蛋白损伤加重,当粒径增大时,损伤区域有减少的趋势;此外相比于25k Gy,25k Gy(辐照保护剂)组胶原结构性破坏减少。差示热量扫描法得出样品热交换曲线,随着粒径增大,热变性温度有增高的趋势,粒径间对比有统计学差异(F=189.4,P<0.001),但同粒径不同辐照剂量间差异不明显;除5.7~7.0mm粒径组之外,相比于25k Gy,25k Gy(辐照保护剂)组热稳定性温度均有不同程度上升。SDS-PAGE发现同粒径下γ辐照剂量愈大,胶原分子量愈小;同辐照条件下随粒径较小,高分子量胶原含量减少明显。羰基含量结果显示在同一粒径下,γ辐照使羰基含量增多:0.5~1.0mm组(F=10.40,P=0.011),1.2~2.8mm组(F=11.26,P=0.009),3.3~4.7mm组(F=6.312,P=0.033),5.7~7.0mm组(F=4.507,P=0.064),同辐照条件下,不同粒径间随着粒径增大羰基含量逐渐减小但无统计学差异;除0.5~1.0mm粒径组之外,相比于25k Gy,25k Gy(辐照保护剂)组羰基含量均有不同程度下降。结论γ辐照与胶原的氧化损伤存在明显的剂量反应关系,随着γ辐照剂量的增加,胶原损伤程度逐渐增加;DBM的粒径大小影响着胶原对γ辐照的敏感度,随着粒径的减小,DBM颗粒更易被γ辐照损伤;辐照保护剂在辐照过程中对胶原有一定程度的保护作用。