本课题由国家自然基金项目(81173519)及北京中医药大学创新团队项目(2011-CXTD-15)资助。受启发于中药的配伍和化药的拼合,本课题组前期基于川穹——丹参、川芎——当归经典药对中的活性成分,设计、合成了川芎嗪系列衍生物108个。经过9种细胞模型系统筛选发现川芎嗪化合物17和化合物4、13、26分别具有神经保护和抗肿瘤先导化合物的研究价值。本论文深入开展上述先导化合物药理活性及其作用机制研究,结合前期工作基础研究内容分为两部分。第一部分川芎嗪衍生物17对分化后神经细胞拟缺血损伤模型的影响川芎嗪衍生物17,结构新颖,是从60种川芎嗪衍生物中初步筛选出来的,具有较强的神经细胞保护活性先导化合物。本课题通过NGF诱导PC12细胞分化,建立体外拟缺血损伤神经细胞模型,进一步探讨该药对神经元作用及其机制。一、化合物17对神经细胞拟缺血损伤模型的影响及其作用机制研究目的:观察化合物17对体外培养PC12细胞在NGF诱导、拟缺血损伤等条件下生长的影响并观察化合物17对损伤神经细胞NF-κB/p65、COX-2的表达情况,探讨化合物17对神经细胞保护作用及作用机理。方法:1.化合物17对神经细胞活性的影响:未分化PC12细胞的生长条件为85%RPMI1640+5%胎牛血清+10%马血清+双抗(100μg·mL-1链霉素和100 青霉素);分化后培养基改为90%RPMI1640+10%胎牛血清+双抗(100μg·mL-1链霉素和100 U·mL-1青霉素);在37℃恒温、5%C02及饱和湿度培养箱中生长。通过NGF对PC12细胞诱导分化并用CoC12作用于细胞12h后建立拟缺血损伤模型,采用MTT法测定化合物17对神经细胞活性的影响。2.化合物17对拟缺血损伤神经细胞凋亡的影响:利用流式细胞仪技术观察不同给药浓度的化合物17对分化后拟缺血损伤PC12细胞凋亡率的变化,探讨化合物17是否通过影响神经细胞凋亡率,从而促进神经细胞增殖,减轻神经细胞损伤程度。3.化合物17对诱导分化拟缺血损伤PC12细胞形态学的影响及其作用机制研究:采用HE染色法,观察不同作用浓度化合物17对分化后拟缺血损伤PC12细胞形态学的变化;采用ICC染色法,分析NF-κB/p65、COX-2的表达。结果:1.熟练掌握了该课题组建立的PC12细胞培养体系,实验结果稳定;并验证PC12细胞分化后拟缺血损伤模型作为神经保护药物筛选模型的可行性;以50ng·mL-1NGF,作用24h诱导PC12细胞分化建立神经细胞模型;以200μmol·L-1氯化结,作用12h为分化后PC12细胞拟缺血损伤造模条件。2.化合物17可使拟缺血损伤神经细胞活性增强,并呈现一定的量效关系,3.75μmol.L-1、7.5μmol·L-1、15μmol·L-1、30μmol·L-1、60μmol·L-1各浓度组的OD值明显高于模型组及川芎嗪组;浓度为60μmol.L-1时OD值明显高于NGF组。3.化合物17可抑制分化拟缺血损伤PC12的凋亡;不同作用浓度化合物17组可显著抑制神经细胞凋亡,提高细胞存活率;15μmol·L-1、30μmol·L-1、60μmol·L-1各浓度组的细胞存活率值明显高于NGF组及模型组。4.化合物17对拟缺血损伤神经细胞形态学的影响HE染色结果:(1)NGF组:与模型组比较,可见细胞体积显著增大,胞核也增大,胞浆较饱满,几乎每个胞体均长出多个突起,长短不一,突起末端呈现楔状的生长锥,相互交错形成网状;(2)模型组:细胞两极突起减少或消失;细胞折光性差,核固缩,核碎裂,核溶解,胞浆少,包膜破裂,细胞坏死;(3)化合物17组:与NGF组相比较,可发现细胞突起数目增多,突起长度增长,特别是高剂量组变化明显。ICC染色结果:(1)NF-KB/p65:化合物17可增加缺氧时NF-κB/p65的表达;(2)COX-2:化合物17可减少缺氧时COX-2的表达。结论:化合物17对拟缺血损伤神经细胞具有保护作用;化合物17具有NGF激动剂活性;其作用机理可能为:化合物17可能通过增加NF-κB/p65的激活,并减少下游因子COX-2的表达,减轻PC12细胞拟缺血后的炎症反应,抑制损伤神经细胞凋亡,对神经细胞起到保护作用。二、结语综上所述,化合物17具有明显的NGF激动剂活性,并能够显著减轻分化后PC12细胞缺血缺氧引起的损伤,随着化合物17浓度的增加对拟缺血损伤的神经细胞保护作用显著增强。其作用机制可能为:抑制神经细胞凋亡,减少下游因子COX-2的表达,进而抑制神经细胞拟缺血损伤后的炎症反应,产生神经保护作用。第二部分川芎嗪衍生物4、13、26的抗肿瘤活性及机制研究基于中医经典药对抗癌活性成分,以拼合原理为指导,设计、合成高效、低毒的抗癌先导化合物,是发现新型抗肿瘤药物的思路之一。川芎嗪具有扩张血管、抑制血小板聚集、抗凝、改善微循环、抗氧化和钙拮抗、抗内皮素和保护血管内皮等作用。川芎嗪衍生物4、13、26是由北京中医药大学中药学院从48种川芎嗪衍生物中初步筛选出来的,具有较强抗肿瘤活性。前期关于这3种化合物的急性毒性试验,未出现毒性反应或较轻,提示这些化合物安全性较高。本文利用MTT比色法完成化合物4、13、26在HepG2、MCF-7、Hela和HT-29等在4种癌细胞模型上的抗肿瘤活性多浓度梯度筛选,并计算出IC50,与阳性药顺铂进行比较。利用AnnexinV-PI凋亡检测试剂盒与流式细胞仪检测先导化合物4、13、26诱导HepG2细胞凋亡的作用;并检测化合物26对HepG2细胞周期分布的影响;采用H22荷瘤小鼠模型检测化合物26对肿瘤生长的抑制作用,为抗肿瘤先导化合物的发现研究提供实验依据。1.抗肿瘤先导化合物的筛选及其IC50值测定为了考察本课题组在研的先导化合物,重点是川芎嗪衍生物的抗肿瘤活性,确定了4种肿瘤细胞的MTT筛选条件,对活性较好的化合物进一步抗肿瘤活性筛选,并计算其IC50值,结果显示川芎嗪衍生物4、13和26的抗肿瘤效果显著,它们抑制肿瘤细胞增殖的作用呈现剂量依赖性,且IC50值与顺铂相当。2.化合物4、13及26诱导HepG2细胞凋亡的检测为了研究化合物4、13和26是否通过诱导凋亡的方式抑制肿瘤细胞增殖,我们利用流式细胞仪对这些化合物作用于HepG2细胞后的凋亡率变化进行了检测,结果显示化合物4、13、26均可浓度依赖性地诱导细胞凋亡,且以早期凋亡为主。3.化合物26影响HepG2细胞周期分布的检测多数抗肿瘤化合物可以诱导细胞凋亡同时具有细胞周期依赖性,因此我们采用流式细胞仪检测了化合物26对HepG2细胞周期分布的影响。结果显示化合物26可使细胞周期的各时相细胞百分数发生显著改变,主要表现为三个不同浓度均使GO/GI期与G2/M期细胞数增加,S期细胞数减少,结果提示化合物26可使细胞停滞在GO/GI期与G2/M期,阻止S期细胞向G2/M期移行,最终诱导细胞凋亡,而且可能以S期为主。4.化合物26对H22荷瘤小鼠模型的抗肿瘤作用化合物26对肿瘤细胞表现出显著的抗肿瘤作用,其作用机制可能与促进肿瘤细胞的凋亡、干扰肿瘤细胞的分裂周期有关。为了探讨其体内抗肿瘤作用,设计了 H22荷瘤小鼠的体内实验。结果表明,化合物26可以显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,给药浓度为30mg/kg(腹腔注射)时抑瘤率达到了 60%以上,并呈现出较低的毒副作用。