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第一部分同源异型框转录因子BARX2在口腔鳞状细胞癌中的表达及其对侵袭的影响目的检测口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)组织中同源异型盒转录因子BARX2的表达,并进一步研究BARX2基因过表达对OSCC细胞系侵袭能力的影响。材料和方法1.应用高通量测序检测4对口腔鳞状细胞癌及相应癌旁正常上皮中转录组mRNA的表达差异。2.应用qRT-PCR法检测并比较45例新鲜OSCC组织和相应癌旁正常上皮中BARX2 mRNA 的表达。3.利用PCDH-puro-BARX2慢病毒重组质粒构建稳定过表达BARX2基因的OSCC 细胞系 Cal-27-PCDH-puro-BARX2 和 FaDu-PCDH-puro-BARX2。以表达PCDH-puro空载体的Cal-27/FaDu-PCDH-puro作为对照细胞系。4.应用 qRT-PCR 和 Western Blot 检测 Cal-27/FaDu-PCDH-puro-BARX2 细胞中BARX2 mRNA和蛋白的表达水平,验证BARX2基因过表达效率。5.应用体外Transwell细胞侵袭实验,检测BARX2基因过表达对OSCC细胞系侵袭能力的影响。6.应用基因芯片初步筛查BARX2基因过表达细胞系中的差异表达基因。结果1.高通量测序结果显示,与正常癌旁组织相比,BARX2在肿瘤组织中的表达明显降低,降低了 5.20-123.95倍。2.qRT-PCR检测结果进一步证实,与正常癌旁组织相比,77.78%(35/45)OSCC中BARX2的mRNA表达下降,其中88.57%(31/35)降低显著[log2(倍数)≥1]。3.在Cal-27细胞系中,与野生型及空载体对照相比,过表达细胞系BARX2的mRNA的表达分别升高了 848.12和188.05倍(***,P<0.001)。Ca127蛋白水平分别升高了 1.57和3.22倍(***,P<0.001)。在FaDu细胞系中,与野生型及空载体对照相比,过表达细胞系BARX2的mRNA表达分别升高了106.30 和 40.42 倍(***,P<0.001);蛋白水平分别升高了 2.88 和 2.58 倍(***,P<0.001)。4.在Cal-27中,野生型、对照组与BARX2过表达细胞系的平均细胞侵袭数分别为 434.6±29.38(mean±SEM)、470.6±52.80(mean±SEM)、207±38.19(mean±SEM)。与野生型及空载体对照相比,过表达细胞系侵袭细胞数量分别下降了 2.09和2.27倍(***,P<0.001);在FaDu中,野生型、对照组与BARX2过表达细胞系的平均细胞侵袭数分别为284±32.50(mean±SEM)、280.4±31.80(mean±SEM)、167.6±33.80(mean±SEM)。与野生型及空载体对照相比,过表达细胞系侵袭细胞数量分别下降了 1.69和1.67倍(***,P<0.001)。5.基因芯片结果表明,在两组细胞系中具有共同表达趋势且差异在1.5倍以上的基因有29个。其中15个基因表达升高,抑制肿瘤侵袭的基因有3个:血清/糖皮质激素调节激酶1(SGK1),在FaDu和Cal-27 BARX2基因过表达细胞系中分别升高1.68和1.77倍;白细胞介素24(IL24),分别升高1.65和3.12倍;早期生长应答蛋白1(EGR1),分别升高1.51和2.13倍。基因表达降低的14个基因中,促进肿瘤侵袭的基因有3个:精氨琥珀酸合成酶1(ASS1),在FaDu和Cal-27 BARX2基因过表达细胞系中分别下降2.80和1.65倍;羧肽酶A4(CPA4),分别下降2.24和3.38倍;角蛋白17(KRT17),分别下降1.58和1.54倍。结论OSCC中BARX2表达部分丧失,且过表达BARX2降低了 OSCC细胞的侵袭能力,提示BARX2表达下降可能是OSCC转移的一个重要因素。第二部分转录因子XBP1对口腔鳞状细胞癌侵袭的影响目的本课题组前期实验结果表明XBP1的高表达与OSCC淋巴结转移密切相关,抑制XBP1降低了 OSCC细胞的侵袭。然而XBP1影响侵袭的潜在机制尚不明确。本实验利用XBP1基因敲减细胞系,筛选、检测XBP1对下游的侵袭相关基因表达的影响,从而探讨XBP1影响OSCC侵袭能力的可能机制。材料和方法1.应用qRT-PCR分别在Cal-27/UM-SCC-23-XBPl-shl细胞及对照细胞中检测潜在的XBP1下游的一系列侵袭相关基因的mRNA的表达,包括AXL,PI3K,LAMA1,C-myc,IL-6,CXCL1,CXCL2,JUN,PPFIBP1,STAT3 以及MAX;EMT 相关基因(N-cadherin,E-cadherin,Slug,Snail 以及 Twist1)、MMPs 及 uPA。2.应用Western Blot检测Cal-27/UM-SCC-23-XBP1-sh1细胞及相应野生型、对照细胞中AXL的蛋白表达水平。3.应用Thapsigargin诱导细胞中XBP1-s的表达;使用半定量RT-PCR验证XBP1-s表达水平。4.应用WB检测Thapsigargin诱导XBP1-s表达后AXL在细胞中的蛋白表达。5.应用免疫组织化学染色技术检测组织芯片中AXL的表达情况。结果1.对课题组前期进行的100例OSCC组织芯片XBP1免疫组化染色结果进行生存分析,XBP1的高表达与较低的5年生存率相关(P=0.027)。COX比例风险模型单因素预后分析结果提示,XBP1的高表达(P=0.036)、肿瘤的临床分期(P=0.006)和病理分级(P=0.004)与预后相关;COX比例风险模型多因素预后分析结果提示,XBP1的高表达(P=0.047)以及肿瘤的病理分级(P=0.007)是预后最为相关的因素。2.与对照细胞相比,AXL,PI3K,IL-6以及C-Myc mRNA的表达水平在XBP1-sh1细胞中显著降低,其中以AXL下降最为显著。与对照细胞相比,AXL 的 mRNA 在 Ca127-XBP1-sh1 和 UM-SCC-23-XBP1-sh1 中分别下降了3.60倍和3.48倍。进一步检测AXL蛋白表达水平发现,与对照细胞相比,AXL蛋白表达水平在Ca127-XBP1-sh1和UM-SCC-23-XBP1-sh1中分别下降了 5.61 倍和 1.58 倍。3.在XBP1-sh1细胞中,MMP1,MMP3以及uPA的mRNA表达水平显著下降;EMT相关基因的表达与对照细胞系相比无显著差异。4.Tg刺激细胞6h后,在XBP1-s的mRNA表达显著提高。5.在Cal-27细胞系中,加Tg刺激后,野生型、对照细胞和XBP1-sh1细胞中AXL的蛋白表达分别升高了 1.52倍1.48倍和4.17倍,XBP1-sh1细胞中AXL蛋白相对表达与对照细胞无明显差异,分别为1.37和1.48。在UM-SCC-23细胞系中,药物刺激后,野生型、对照细胞和XBP1-sh1细胞中AXL的蛋白表达分别升高了 1.75倍、1.17倍和28.59倍,XBP1-sh1细胞中AXL蛋白表达接近对照细胞,相对表达量分别为1.17和1.67倍。6.免疫组化结果显示,AXL在癌旁正常上皮、肿瘤中心、肿瘤前沿和转移淋巴结中的表达呈递增趋势。结论在OSCC中,XBP1的表达下调会显著抑制AXL及其下游MMPs和uPA的表达。提示AXL可能是XBP1抑制OSCC转移的一个重要下游靶点。