论文部分内容阅读
骨质疏松是现阶段中老年人群发生的常见疾病,其特点主要为骨吸收过度,造成骨量减少,骨脆性增加,从而易发生骨折。骨质疏松症的发生主要是由于骨吸收和骨形成的平衡被打破所导致,其主要依赖于成骨细胞(骨形成效应细胞)和破骨细胞(骨吸收效应细胞)的活性状态。在口腔领域,由于糖尿病骨质疏松患者体内骨改建平衡被打破,其种植体骨结合效率受到影响。有报道显示,高葡萄糖水平可以降低成骨细胞矿化,通过增加核因子κB受体活化因子配体(Ligand of receptor activator of NF-kB,RANKL)的表达、降低骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)表达来影响成骨分化,同时,高糖水平还可抑制破骨细胞分化生成和骨吸收功能。双膦酸盐作为临床治疗骨质疏松的主要治疗药物,现已被证实能有效预防糖尿病性骨质疏松症的骨质流失。作为双膦酸盐的主要类型,唑来膦酸盐对成骨细胞和破骨细胞在高塘环境下分化生成和功能影响的分子学机制尚不清楚。例如,腺苷酸活化蛋白激酶AMPK通路是否在唑来膦酸盐的上述作用中发挥了作用,需要进一步实验加以证实。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated proteinkinase,AMPK)通路可调节细胞能量稳态,参与细胞凋亡、细胞增殖和细胞分化。现有研究显示,AMPK通路也可影响骨代谢活动。研究证实,AMPK可刺激成骨细胞的增殖、分化和骨形成,抑制其细胞的凋亡;激活AMPK通路能促进骨形成并抑制骨吸收。但AMPK相关通路是否参与调控了唑来膦酸盐对成骨细胞和破骨细胞在高塘环境下分化生成和功能影响,现阶段未有相关研究报道。方法:结合当前国内外研究现状,本论文分为两部分分别研究唑来膦酸盐对成骨细胞和破骨细胞在高塘环境下分化生成和功能影响,并进一步探讨相关分子学机制。第一部分,唑来膦酸盐通过调控AMPK/OPG/RANKL信号通路促进高糖条件下MC3T3-E1细胞成骨分化和骨生成。本部分实验应用MC3T3-E1细胞向成骨细胞方向分化诱导。实验分成四组:低葡萄糖组,高葡萄糖租、低葡萄糖+ZOL组、高葡萄糖+ZOL组。实验进行MC3T3-E1细胞增殖、细胞迁移、成骨分化及骨形成功能检测,为了进一步研究涉及的分子学通路,实验加入AMPK拮抗剂Compound C和AMPK激动剂 AICAR,应用 Real-time PCR 及 western blot 检测 AMPK、磷酸化 AMPK、骨保护素、核因子κB受体活化因子配体,骨形成蛋白2(Bone morphogenetic protein2,BMP2)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenI,COLI)的mRNA和蛋白表达情况。第二部分:唑来膦酸盐和高糖水平通过调控AMPK/NFATc1/SYK通路影响破骨细胞分化生成和骨吸收功能。本部分研究应用RAW264.7细胞向破骨细胞方向分化诱导。实验分成四组:低葡萄糖组、高葡萄糖租、低葡萄糖+ZOL组、高葡萄糖+ZOL组。实验进行RAW264.7细胞增殖、细胞迁移、破骨细胞密封区的完整性、破骨细胞分化、骨吸收功能检测;在加入AMPK拮抗剂Compound C和AMPK激动剂AICAR的条件下,Real-time PCR及western blot检测AMPK、磷酸化AMPK及调控破骨细胞分化和功能关键因子活化T细胞核因子 c1(Nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1,NFATc1)、脾酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase,SYK)、组织蛋白酶 K(Cathepsin K,CTSK)和抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)的 mRNA和蛋白质的表达情况。结果:1)高糖条件促进了 MC3T3-E1细胞的迁移,抑制了成骨细胞分化和骨生成,并抑制AMPK、磷酸化AMPK、骨保护素、骨形成蛋白2、Ⅰ型胶原蛋白的表达。2)唑来膦酸盐激活AMPK、磷酸化AMPK、骨保护素、骨形成蛋白2、Ⅰ型胶原蛋白的表达,通过调控AMPK/OPG/RANKL信号通路促进高糖条件下成骨细胞分化和骨生成。3)高糖促进了 AMPK、磷酸化AMPK的表达,同时抑制活化T细胞核因子c1、脾酪氨酸激酶、组织蛋白酶K和抗酒石酸酸性磷酸酶的表达,从而抑制破骨细胞的分化生成和骨吸收功能。4)唑来膦酸盐的加入,进一步促进AMPK、磷酸化AMPK的表达,抑制活化T细胞核因子c1、脾酪氨酸激酶、组织蛋白酶K和抗酒石酸酸性磷酸酶的表达,通过调控AMPK/NFATc1/SYK信号通路抑制破骨细胞的分化生成和骨吸收功能。结论:本研究证实了 AMPK通路在唑来膦酸盐对高糖条件下成骨细胞、破骨细胞分化生成和功能影响的调控作用。研究结果为探讨高糖条件下双膦酸盐对成骨细胞、破骨细胞分化和功能的影响及研究相关AMPK通路调控作用机制提供了新的思路,将为临床上双膦酸盐治疗糖尿病骨质疏松及提高糖尿病骨质疏松种植体骨结合成功率提供基础研究依据,并据此推测AMPK通路可能是糖尿病性骨质疏松症治疗的一个新的潜在靶点。